实时荧光定量PCR(real-time PCR)的Ct值是什么意思?

摘 要:

Ct值(Cycle threshold,循环阈值)是荧光定量PCR中很重要的概念。Ct值是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

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实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次PCR循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。

实时荧光定量PCR(real-time PCR)的Ct值是什么意思?

1Ct值(Cycle threshold,循环阈值)的定义

在荧光定量PCR技术中,有一个很重要的概念就是Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

实时荧光定量PCR(real-time PCR)的Ct值是什么意思?

2、荧光阈值(threshold)的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光阈值的缺省(默认)设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即:threshold = 10*SDcycle 3-15

3Ct值与起始模板的关系

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,公式如下。

Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

n为扩增反应的循环次数,X0为初始模板量,Ex为扩增效率,N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。

起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

正常情况下,所有Ct值的范围都应该在15-35之间,在22-26之间最理想。不过一些专家认为Ct值在10以上就可以接受,不需要那么严格。上限在35-40不那么准,但如果只是为了测个定性也可以接受。

4Ct值的重现性

PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。

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