微生物组学实验中样品采集的均质化与低温保存

摘 要:

微生物组学实验中样品收集和储存方法引起的变化越小越好。原始样品的保真性从收集样品的那一刻就开始了。第一步需要确保的是获得的是一个均匀的样品。对于样品低温冻存可能有助于样品的保存。RNAlater最初是作为一种RNA保存剂,由Qiagen和Thermo Fisher等厂家开发出来的,现在也可以用于保存DNA。

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微生物多样化多到可怕,而且复杂。任何特殊处理都会改变其组成部分。即使是微生物菌群最小的变化或者相对丰度改变,也会极大的干扰群体比对,因此微生物组学实验中样品收集和储存方法引起的变化越小越好。

1、样品均质化

原始样品的保真性从收集样品的那一刻就开始了。第一步需要确保的是获得的是一个均匀的样品,2015年,一组研究人员完成了一项人肠道微生物组的研究,他们将液氮粪便样品通过研钵及研杵捣碎,使之成为粉末状小样品,然后转移到试管中,−80°C储存。比较于之前的方法,这种制备样品的方法能减少微生物组成上出现的可变性。

土壤样品具有更加复杂的组分,因此科学家们建议将土壤样品放到搅拌机中,充分搅碎颗粒物。他们也建议在初次收集样品后再进行多次等分分装,因为多次反复冻融会破坏核酸,这一点其实很多实验室研究人员都知道。比如研究人员可以采用无菌一次性活检钳(biopsy punch)从一个更大的原始样品中收集几乎相同大小的冻存粪便颗粒,然后直接将这些颗粒放入含有核酸裂解液中的提取管中。这种方法就是对原始样品进行等分,可以为科学家们节约一次冻融重复循环。

2014年,美国福赛思研究所、麻省综合医院(MGH)和哈佛大学公共卫生学院等处的科学家,开发出一种新的方法,收集用于基因组和转录组分析的唾液与粪便。该方法不需要专业人员和设施,同时还能保持样品的完整性。研究人员设计了固定剂的选择和取样流程,可让8名受试者在家里收集微生物样品,然后将其运至实验室进行多种类型的分子分析。尽管采用不同的取样方法,微生物种类、基因和基因转录组成,在所有样品中都是一致的。随后对这些样品进行的分析表明,测量的人类微生物组的功能潜力和功能活性之间存在着有趣的异同点。在这项研究中是目前为止,结合表型分类学、宏基因组学和宏转录组数据谱,进行的第一个人类微生物组研究。结果详细描述了肠道菌群基因组潜能和基因表达之间的关系,验证了在受试者收集和运输的样品中开展宏转录组研究的可行性。

2、样品需要低温冻存保存剂吗?选择哪一种?

对于样品的保存,低温冻存保护可能有助于样品的保存。在比较储存样品和新鲜样品中的微生物组成之前,可以采用一种快速的方法,来评估保护剂的作用,那就是检测一下样品DNA的量,如果DNA量不足,那么你采用的方法也许并不适用于这种微生物的保存。

RNAlater最初是作为一种RNA保存剂,由Qiagen和Thermo Fisher等厂家开发出来的,现在也可以用于保存DNA。

RNAlater是特殊的样品储存液,只要在采样后立即将新鲜样品浸入这种液体试剂,RNlater可以迅速渗透到组织或其他生物样本中,稳定并保护RNA完整而不被降解,确保下游分析得到的数据真实反应样品的表达信息。

人类微生物组计划(Human Microbiome Project)的参与研究人员,来自哈佛大学的计算生物学家Curtis Huttenhower与他的同事们发现在样品收集后,如果没有冰箱,那么可以加入这种保护剂使用。

不过一些用户也报告了RNAlater的缺陷,虽然RNAlater可以用于样品运输,但是这种保护剂会降低Bacteroidetes和Ruminococcaceae两种细菌新鲜提取后的菌群数量。另外就是如果想获得样品高RNA产量,那么就必须先将其去除。Ganz表示,“RNAlater会妨碍样品正常形成颗粒沉淀,因此在去除RNAlater之后,还必须磷酸盐缓冲液进行清洗。”

此外,Woods Hole海洋研究所海洋生物化学家Mak Saito也指出,RNAlater还有一个问题,那就是其高盐含量,因此在一些实验中会令样品清洗成为问题。Saito曾采用这种溶液保存海洋微生物组中的蛋白组成。

对于一些类型的实验样品来说,如果加入低温冻存保护剂就会大幅度改变微生物组成,这样做划不来,比如土壤样品。而对粪便样品而言,有时低温冻存也许并不合适,比如说,用于治疗艰难梭菌感染的样品能在室温下保存长达6个小时,而且还不会引起治疗疗效发生显著变化。

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