微生物样本取样及微生物基因组DNA提取建议

摘 要:

想得到好的测序结果,首先得有个高质量的DNA样品,所以取样与DNA提取是大家普遍关心的问题。本文整理了各种微生物样本的取样和基因组DNA提取方法。采集的样本包括人粪便、小鼠粪便、土壤微生物、肠道内容物\粘膜\瘤胃微生物、生殖道微生物、口腔微生物、皮肤微生物、血液微生物、植物内生菌微生物、空气微生物、水体微生物、活性污泥及海洋沉积物微生物和物体表面微生物。

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想得到好的测序结果,首先得有个高质量的DNA样品,所以取样与DNA提取是大家普遍关心的问题。本文整理了各种微生物样本的取样和基因组DNA提取方法,超实用干货!

一、粪便

(一)人粪便取样方法

1、用无菌的粪便收集器或其他器皿收集病人和健康人新鲜的粪便样本;

2、在实验室将装好病人和健康人体检后的粪便样本立即放在冰上进行分装并标记;

3、用无菌牙签或粪便取样器截取样品中段里部,外部容易污染,且接触空气后,部分细菌DNA开始降解;

4、用灭菌离心管每管称取0.2g左右粪便样本,每个样本总共10管,分装好后立即放入-80℃保存;

5、 每次实验使用一管,未用完丢弃。

(二)小鼠粪便取样方法

1、将待取样的小鼠放进干净的铺有消毒滤纸的笼子里,小鼠排便后立即收集粪便样本。不同的小鼠取样要更换新的滤纸;

2、单个小鼠用灭菌离心管称取0.2g样本,分装好后立即放入-80℃保存;

3、单个小鼠粪便样本不满足0.2g,根据课题需求,可以将多个小鼠粪便样本混合为一个样品;

4、样本珍贵,需进行备份。

粪便样品微生物DNA提取方法

(三)粪便样品微生物DNA提取方法

手工提取参考文献:Furet JP, et al. Comparative assessment of human and farm animal faecal microbiota using real-time quantitative PCR [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2009, 68(3):351-362.

推荐试剂盒:

QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit

PowerFecal® DNA Isolation Kit

二、土壤微生物

(一)取样方法

1、根据研究设计选择具有代表性的土壤;

2、采样所有工具、塑料袋或其他物品都要事先灭菌,或用采取的土壤擦拭;

3、取 5-10cm处土壤,多点采取重量相当的土壤进行混匀,去除杂质后再取一定量土壤装袋(无菌管),每个样品取样5-10g;

4、密封后立即-80℃保存。

(二)土壤微生物DNA提取方法

手工提取参考文献:Clegg C D, et al. Direct extraction of microbial community DNA from humified upland soils [J]. Letters in applied microbiology,1997, 25(1):30-33.

推荐试剂盒:

MoBio PowerSoil®DNA Isolation Kit

三、肠道内容物\粘膜\瘤胃微生物

(一)肠道内容物取样方法

1、在实验对象死亡后,用无菌解剖刀,在无菌状态下取出整个肠道,切取所需肠段的内容物;

2、用无菌手术刀挖取内容物置于无菌的离心管中,放在冰盒中(建议使用干冰)运回实验室;

3、立即进行DNA抽提。如果不能立即抽提,建议将样本先置于液氮中冷冻4小时以上,再转移到-80℃保存;

4、单个样本取样量:大型动物,如牛、羊500-1000mg/管;中型动物,如大鼠、家兔 200-1000mg/管;小型动物,如小鼠 200-500mg/管;对于肠道内容物较少动物,如鱼、 虾≥100 mg/管。为保证实验顺利进行,在采样允许的情况下,尽量多采集样品。

内容物微生物DNA提取方法

推荐试剂盒:

QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit

OMEGA E.Z.N.A.® Stool DNA Kit

(二)肠道粘膜微生物取样方法

1、在无菌环境中将整个肠道移出体外;

2、取不同部位肠段,然后在肠系膜的对面纵向切开,使肠腔外露;

3、用无菌取样器对内容物进行取样、保存;

4、将肠道内容物清理干净后,用无菌生理盐水轻轻清洗肠腔,清除看得见的肠容物(避免扰乱肠粘膜);

5、用无菌载玻片轻刮肠道粘膜(避免穿透基底膜)。所有样品取完后立即放入液氮冷冻,并放在-80℃冰箱保存。

可参考:Yasuda K, et al. Biogeography of the intestinal mucosal and lumenal microbiome in the rhesus macaque [J]. Cell host µbe,2015,17(3):385-391.

肠道粘膜微生物DNA提取方法推荐试剂盒:MP BIO FASTDNA™ SPIN Kit for Soil (MP Bio, Santa Ana, CA)

(三)瘤胃微生物

样本制备及DNA提取可参考:Singh K M, et al. Methanogen diversity in the rumen of Indian Surti buffalo,assessed by 16S rDNA analysis [J]. Research in veterinary science,2012,92(3):451-455.

四、生殖道微生物

取样方法

1、48h内无性行为,不得进行私处清洗、上药等改变菌群结构的行为,30天内不能用抗生素和抗真菌类药物;

2、用无菌棉签充分取样,用无菌剪刀剪下棉签头部,放入装有Amies培养基的无菌离心管中,置于冰上带至实验室-80℃保存;

3、样本珍贵,需进行多管备份保存;

4、提取DNA时将棉签解冻,漩涡处理5min以重悬细胞。

生殖道微生物DNA提取方法:推荐试剂盒:QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)

五、口腔微生物

取样方法一

1、24h内不刷牙,早饭后2h取样(或根据研究选择特定时间段);

2、取样前漱口,然后用无菌金属环刮取牙齿表面10次;

3、将金属环放入装有1ml盐溶液的1.5ml无菌离心管,盐溶液经过UV照射以避免DNA污染;

4、将样品置于冰上,运至实验室,-80℃保存;

5、样品用无菌蒸馏水悬浮,10,000×离心10min。

取样方法二

1、24h内不刷牙,早饭后2h取样(或根据研究选择特定时间段),使用特定唾液取样器;

2、待取样人向取样器中吐2-3次唾液(一次约1ml);

3、将DNA稳定剂加到唾液中;

4、密封后,做好样品标记;

5、-80℃保存。

口腔微生物DNA提取方法:推荐试剂盒:QIAamp DNA Mini Kit

六、皮肤微生物

取样方法

1、取样前24h不能洗澡,不能使用润肤乳及抗菌活性的肥皂等;取样前7d不能使用抗菌成分的沐浴用品;

2、取样区域为4cm2,采用棉签( Catch-All™ Sample Collection Swabs)或无菌手术刀片轻轻刮取皮肤表面取样;

3、指甲样品剪碎后用蛋白酶K过夜55℃处理,其他样品用yeast lysis buffer and lysozyme处理1h(37℃);

4、样本珍贵,需进行多管备份保存。-80℃保存。

皮肤微生物DNA提取方法:推荐试剂盒:Invitrogen PureLink Genomic DNA Kit

七、血液微生物

取样方法

1、用EDTA抗凝管抽取1-2ml全血;

2、颠倒抗凝管 8-10 次,充分混匀EDTA 和全血,保证抗凝效果;

3、-20℃保存。

血液微生物DNA提取方法:推荐试剂盒:QIAamp DNA Blood Mini kit

八、植物内生菌微生物

取样方法

1、根据研究选取新鲜植物组织;

2、依次用70%无水乙醇和2.5%次氯酸钠,浸泡40s和10min,每100ml 2.5%次氯酸钠加一滴吐温80;

3、无菌水清洗2-3次;

4、进行核酸提取实验或放置-80℃保存。

植物内生菌微生物DNA提取方法:

内生细菌样本DNA提取参考文献:

Shi YW, et al. Illumina-based analysis of endophytic bacterial diversity and space-time dynamics in sugar beet on the north slope of Tianshan mountain [J]. Applied microbiology and biotechnology, 2014,98(14):6375-6385.

内生真菌样本DNA提取参考文献:

Sessitsch A, et al. Functional characteristics of an endophyte community colonizing rice roots as revealed by metagenomic analysis [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions,2012,25(1):28-36.

九、空气微生物

取样方法

雾霾(所有工具每天更换,用75%酒精洗涤)

1、抽取针对实验目的空气微颗粒,用不同孔径大小的无菌滤膜筛选目的颗粒;

(将含颗粒过滤膜装入无菌铝箔内,密封在-80℃长期保存)

2、截取适量大小过滤膜,置于含1×PBS缓冲液的50ml离心管;

3、在 4℃条件下,用200g加速度离心2h;

4、温和漩涡处理,0.2μm的Supor 200 PES Membrane Disc Filter 过滤纸过滤重悬液。

参考文献:Optimized DNA extraction and metagenomic sequencing of airborne microbial communities

空气微生物DNA提取方法

推荐试剂盒:

MoBio PowerSoil DNA isolation kit

十、水体微生物

取样方法

1、水体的取样深度和范围,可以根据研究目的进行确定;

2、采样后进行滤膜过滤,选择合适孔径的滤膜,对于澄清水体或者略浑浊水体,选用0.22μm或者0.45μm的滤膜,取样体积大于5L;对于浑浊水体,建议先用大孔径的滤膜过滤一遍,再用小孔径的滤膜过滤。水体泥样的采集提供大于5g样本。

3、取过滤后的滤膜或者洗脱滤膜的缓冲液进行核酸提取实验。

水体微生物DNA提取方法

手工提取参考文献:

Shi P et al. Metagenomic insights into chlorination effects on microbial antibiotic resistance in drinking water [J]. Water research,2013,47(1):111-120.

推荐试剂盒:

MoBio PowerWater® DNA Isolation Kit

OMEGA E.Z.N.A.® Water DNA Kit

十一、活性污泥及海洋沉积物微生物

取样方法

1、活性污泥:从活性污泥装置中取大于20ml的悬浮污泥样本,置于无菌管中,放入液氮或置于冰上,快速运送置实验室进行DNA提取;

2、海底沉积物:依据研究目的,取距离地表0-10cm的沉积物;

3、取1kg以上的沉积物装入无菌的塑料袋中,放在冰上运送至实验室。

活性污泥及海洋沉积物微生物DNA提取方法

推荐试剂盒:

UltraClean Mega Soil DNA Isolation kit

PowerMax Soil DNA Isolation Kit

十二、物体表面微生物

取样方法

1、形状较小物体:将物体置于无菌的容器中,加入PBS进行冲洗,振荡使微生物脱落到PBS中,利用PBS提取DNA或者经滤膜过滤之后进行DNA提取;

2、形状较大物体:采用无菌棉签沾取无菌水擦拭物体表面取样,或用无菌手术刀片轻轻刮取物体表面取样;

3、无菌离心管收集样品,-80℃保存。

物体表面微生物DNA提取方法

DNA提取可参考文献:Hewitt KM et al. Office space bacterial abundance and diversity in three metropolitan areas [J] PLOS ONE, 2012.

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  1. avatar 匿名

    学习了,这个站点很好,要及时更新哦o(* ̄︶ ̄*)o

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