硫酸铵沉淀法盐析纯化抗体或蛋白的原理、方法和注意事项

摘 要:

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来,这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

关键词: , , ,

一、基本原理

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的蛋白从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质,这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

二、试剂及仪器

硫酸铵(NH4)2SO4饱和硫酸铵溶液(SAS)、蒸馏水、PBS (含0.2g/L叠氮钠)、透析袋、超速离心机、pH计、磁力搅拌器。

三、操作步骤

以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体蛋白的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%-50%。

(一)配制饱和硫酸铵溶液(SAS)

1、将767g硫酸铵边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液(4.1 mol/L,25℃)。

2、其它不同饱和度铵溶液的配制

(二)沉淀

1、样品(如腹水)20 000g离心30 min(4℃),除去杂质沉淀;

2、保留上清液并测量体积;

3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中,终浓度为1:1;

4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜(4℃),使蛋白质充分沉淀。

(三)透析

1、蛋白质溶液10 000g离心30 min(4℃)。弃上清保留沉淀;

2、将沉淀溶于少量(10-20ml )PBS-0.2g /L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋,对PBS-0.2g/L叠氮钠透析24-48小时(4℃),每隔3-6小时换透析缓冲液一次,以彻底除去硫酸氨;

3、透析液离心,测定上清液中蛋白质含量。

四、注意事项

(一) 先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白。

1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中,使浓度为0.5:1 (v/v);

2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜(4℃);

3、3000g离心30 min(4℃),保留上清液;

4、上清液再加SAS到0.5:1(v/v),再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS,透析除去硫酸氨;

5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白非常有效。

(二)为避免体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析;硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用,可得到更进一步纯化的抗体。使用固体硫酸铵和硫酸铵饱和溶液,各有各的优缺点,比较如下:

1、造成蛋白质变质的程度:固体的硫酸铵>硫酸铵饱和溶液

利用硫酸铵饱和溶液,滴入的速度可以很快而不造成变质。不像固体硫酸铵只能磨碎慢慢加入,速度一快蛋白质变质(溶液有致密的白色气泡产生)。

2、操作的容易度:硫酸铵饱和溶液>>固体硫酸铵

固体硫酸铵最大的缺点就是不易操作,要一直敲敲敲又不能太快,所以当要溶解的蛋白质很多时,这是很累的步骤。然而硫酸铵饱和溶液比较麻烦只有在配制部分,要先加热让它饱合后,回到操作温度让它过饱和,最后用滤纸把硫酸铵结晶去掉。

3、蛋白质溶液的体积放大程度:硫酸铵饱和溶液>>固体硫酸铵

这是使用硫酸铵饱和溶液最头痛的部分,举例来说,要让100 m的硫酸铵百分比从0%到25%,如果是加入固体的硫酸铵,只会让溶液从100 ml变成107 ml左右,但若是加入硫酸铵饱和溶液,会让溶液变成125 ml。而且若是要提高到50%,须加等量的硫酸铵饱和溶液,所以会让蛋白质溶液从100 ml变成200 ml。

    A+

除注明外,本站内容由 细菌之家 原创或整理,转载请注明出处及链接。

本文永久链接: http://www.bacteria.cn/html/2017/2033.html

  • 请您留言:专业水平所限,谬误之处在所难免。如您发现不正之处,请在下面留言,谢谢!

发表评论

:?: :razz: :sad: :evil: :!: :smile: :oops: :grin: :eek: :shock: :???: :cool: :lol: :mad: :twisted: :roll: :wink: :idea: :arrow: :neutral: :cry: :mrgreen:

图片 表情