基于适配体的病原细菌检测方法

摘 要:

食品、医药、环境等领域中的细菌检测具有重要的实用意义。近年来筛选的适配体已经可以部分替代抗体用于细菌的分析检测。适配体的高特异性与高亲和力的特点,使其可以很好地用于识别和捕获靶标细菌,基于此可设计多种细菌分析方法。目前用于细菌检测的适配体方法有酶联免疫、同位素标记、荧光标记、核酸染料、电化学传感器、纳米金颗粒、夹心法以及多适配体联合等。

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食品、医药、环境等领域中细菌的检测非常普遍,具有重要的实用意义。基于抗体的细菌检测技术,因其速度快、特异性高而倍受青睐。近年来筛选的适配体已经可以部分替代抗体用于细菌的分析检测。目前筛选的适配体的Kd值在10-103 nmol/L,对不同细菌的检出限因所用分析方法不同差别较大,其范围在102 -106 CFU/mL之间。适配体的高特异性与高亲和力的特点,使其可以很好地用于识别和捕获靶标细菌,基于此可设计多种细菌分析方法。目前用于细菌检测的适配体方法有酶联免疫、同位素标记、荧光标记、核酸染料、电化学传感器、纳米金颗粒、夹心法以及多适配体联合等。

1、用适配体固定细菌的酶联免疫分析

为了从S. aureusE. coli O157:H7的混合菌液中检测Sal. typhimurium,将5’端标记生物素的RNA适配体固定在包被有亲和素的96孔板上,再将细菌样品在96孔板上室温孵育1h,洗脱未结合的细菌后,加入该细菌特异性的抗体(一抗),再孵育、洗脱后,加入带有辣根过氧化物酶标记的二抗,再加入过氧化物酶底物溶液,在酶标仪中检测425nm处的吸光值。利用酶联免疫吸附测定(ELISA)原理,以适配体取代抗体固定抗原,可定量分析Sal. typhimurium,而不受其他细菌干扰。

2、放射性标记适配体的液体闪烁计数法

使用带有同位素标记的适配体,则可以免除后续一抗、二抗的使用,直接进行检测。如在小牛肠磷酸酶作用下将RNA适配体5’端脱磷酸后,用[γ-32P]ATP( 腺苷三磷酸)在T4多聚核苷酸激酶作用下磷酸化,得到5′端有32P标记的适配体。将待测的S. typhimurium包被在96孔板上,与带有32P标记的RNA适配体在室温下共同孵育1h,冲洗后用液体闪烁计数器测定与靶标细胞结合的带有同位素标记的适配体,从而对靶标进行定量,但是这种方法检出限较高(106 CFU/mL)。

3、荧光标记适配体的荧光光谱法

除了同位素标记,也可以在适配体上修饰荧光基团,用双适配体夹心法进行细菌分析。如将生物素修饰的适配体包被在96孔板上,与靶标志贺氏菌在室温下共同孵育1h,冲洗去除未结合的志贺氏菌后,加入带有FAM荧光标记的适配体在室温下孵育1h,冲洗2次后测定荧光强度,检出限可达50 CFU/mL,并且在 102 - 107 CFU/mL范围内都有良好的线性关系(R2=0. 995 4)。

4、量子点标记适配体的荧光光谱法

与使用荧光基团标记类似,在适配体上可以修饰量子点标记。有人将带有量子点标记的适配体与靶细胞V. parahaemolyticusS. typhimurium在37 ℃下共同孵育1h后,于3000 r/min下离心除去未结合的适配体。使用流式细胞仪对适配体-细菌复合物进行分离计数。此外,用于针对两种不同细菌的适配体上分别修饰了535nm和585nm两种不同的量子点标记,在流式细胞分选时可以同时检测两种细菌。相对于荧光基团标记,量子点荧光的发射波长有更多的选择,有利于多通道检测,能够实现同时检测多种细菌。

5、上转换荧光纳米颗粒修饰适配体的荧光光谱法

上转换荧光纳米颗粒(upconversion nanoparticles,UCNP)利用抗斯托克斯发光(anti-Stokes)产生长寿命荧光, 可以有效排除背景中细菌自发短寿命荧光的干扰,提高荧光信号的信噪比。使用多色UCNP分别标记了针对S. aureusV. parahaemolyticusS. typhimurium的适配体,结合磁分离技术,在牛奶、对虾样品中同时检测这3种致病菌,结果与传统平板计数法一致。

6、核酸染料辅助的适配体检测方法

AccuBlue染料可以与双链DNA(dsDNA)结合产生较强的荧光,但它单独存在时或与ssDNA结合后产生的荧光较弱。将AccuBlue染料、适配体、与适配体互补的ssDNA结合使用,可以用于细菌的定量检测。检测方法分为两种模式:(1)“signal on” 模式。将靶标细菌与一定量的适配体共同孵育,形成靶标-适配体复合物, 再加入适配体的互补序列与AccuBlue染料,体系中游离的适配体与互补序列形成dsDNA,结合染料后产生荧光,测定荧光强度的增加即可知游离的适配体浓度,进而推算靶标浓度。(2)“signal off” 模式。将适配体与其互补序列先形成dsDNA与AccuBlue染料产生荧光,再加入靶标细菌与互补序列竞争结合适配体,导致荧光强度随着dsDNA的减少而降低。对V. parahaemolyticusS. typhimurium的检出限分别达到35 CFU/mL和25 CFU/mL。由于是通过dsDNA间接测定适配体-靶标复合物的浓度,因此针对不同样品需要对核酸染料的用量进行优化,才能得到较显著的荧光强度的变化,以保证检测的特异性和灵敏度。

7、双适配体夹心法

双适配体夹心法(aptamer-based sandwich assay,ABSA)将适配体固定在96孔板上, 加入样品孵育30min后,冲洗除去未结合的细菌,再加入带有荧光修饰的适配体孵育,冲洗去除游离的适配体后测定荧光强度。Lee等使用L. monocytogenes的适配体对不同浓度的靶标细菌的菌悬液进行了测定,线性范围为20-200 000 CFU/mL。

8、多适配体联合的荧光成像法

细菌表面的蛋白质、多糖以及鞭毛等都有可能成为适配体作用的靶标。故对同一细菌有可能筛选到针对蛋白质、多糖以及鞭毛等多种靶标的不同适配体。将这些适配体联合使用,有助于对全细胞的高特异性结合,可以显著提高检测灵敏度与特异性。如使用量子点标记的3组不同适配体与E. coli结合,通过荧光成像发现这3组适配体可以同时非竞争性地与靶标E. coli结合。联合使用这3组适配体相对单独使用一种适配体,对E. coli的检出限从103降低到102 CFU/mL。

9、适配体修饰的阻抗传感器法

适配体也可以与电化学检测器联用,从而提高灵敏度,进一步降低检出限。有人将筛选得到的鼠伤寒沙门氏菌的适配体用硫醇修饰后,通过自组装结合到纳米金修饰的碳电极上。通过测定适配体与靶标结合前后阻抗的变化,即可对靶标进行定量、定性分析。该方法可以从30 μL样品中检出最低18个细胞,且只检测活的鼠伤寒沙门氏菌,对灭活的鼠伤寒沙门氏菌则没有响应。电化学的检测方法有利于便携检测仪器的开发。

10、纳米金颗粒的比色法

先用纳米金颗粒吸附鼠伤寒沙门氏菌或大肠埃希氏菌的适配体。当这些适配体捕获靶标后,纳米金颗粒会聚集沉淀,其溶液颜色由红变紫,通过测定吸光度的变化,可对靶标细菌进行定量。纳米金颗粒对非靶标的其他种属的细菌如S. paratyphi A金黄色葡萄球菌的吸附较少,故溶液颜色没有变化。该方法的检测特异性较好,但检出限较高(105CFU/mL)。

参考文献:

陈尔凝, 赵新颖, 屈锋. 细菌的核酸适配体筛选的研究进展. 色谱, 2016,34(4):389-396

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