适配体与靶标的亲和力与特异性分析

摘 要:

适配体与靶蛋白的作用强弱取决于二者的结合位点。适配体的特异性还与其亲和力相关,亲和力越高的适配体,其与蛋白质靶标的结合能力越强,但特异性可能降低。测定适配体与靶标亲和力的方法有透析法、超滤法、凝胶电泳法、毛细管电泳法、液相色谱法等。也可采用不需分离的方法,包括荧光各向异性/偏振、紫外光谱法、表面等离子共振和等温滴定热量测定法等。

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由于蛋白质靶能为适配体提供更大的相互作用区域,其与适配体结合的亲和力明显高于与小分子的作用,蛋白质结合适配体的解离常数为10-11 ~ 10-9 mol/L,高出小分子的解离常数( 通常为10-5 ~ 10-7 mol/L)2-4个数量级。

具有一定亲和力的适配体与蛋白质靶标结合时还需考虑结合的特异性。适配体与靶蛋白的作用强弱取决于二者的结合位点。因不同蛋白质具有的空间结构的可变区不同,若适配体结合在蛋白质的空间结构可变区域,其特异性将比其结合在保守区域更强。

适配体的特异性还与其亲和力相关,亲和力越高的适配体,其与蛋白质靶标的结合能力越强,蛋白质分子表面的空间构象的改变可能影响适配体的特异性,使特异性降低。此外,蛋白质的同源程度也对适配体特异性也有一定影响,这种影响还因蛋白质而异。如HIV-1病毒的马达蛋白的适配体能够识别HIV-2病毒的马达蛋白,亲和力是HIV-1病毒的马达蛋白的65%。而蛋白激酶C的适配体与其同源蛋白质的亲和力仅为蛋白激酶C的4%。经过定点突变的凝血酶、HIV-1病毒逆转录酶、丙型肝炎病毒复制酶,这些突变蛋白质与适配体的复合物的解离常数较未突变蛋白相比,均提高了1-2个数量级。

不同靶蛋白质的同源蛋白质与其适配体的亲和力有较大差异。据此可推测这些适配体可能通过与蛋白质靶上的某些单个氨基酸的相互作用进行蛋白质的识别。而这个与适配体相互作用的氨基酸可能存在于蛋白质的同源区域也可能存在于蛋白质的非同源区域。此外,适配体对靶蛋白质的同源蛋白质的亲和性还与适配体的筛选方法有关。因此,在适配体筛选过程中,可根据特异性需要对筛选步骤进行优化。

不同蛋白质适配体筛选的需求和目的不同。有时,并非一个蛋白质对应一个适配体。行使相同功能的蛋白质家族(仅有一个或者几个氨基酸的差异,这种差异可能与蛋白质功能无关),如要筛选的适配体是能够作用于其功能结构域的,即同一家族蛋白质的功能一样,功能结构域也相同,则所筛选的适配体不需要对这一家族蛋白质逐个进行区分。然而,如果仅需要筛选其中某种蛋白质的适配体,目的是将这种蛋白质与其同源蛋白质区分开,则需要通过反筛等手段筛选出该蛋白质的高特异性的适配体。因此,如果需要区别靶蛋白质与其相关蛋白质,则需选择对某种蛋白质具有高特异性结合的适配体。反之,如果需要对几种相关蛋白质同时进行适配体筛选,如筛选不同物种中的直系同源蛋白质的适配体,则可同时将几种蛋白质作为靶标进行SELEX。

适配体与靶标亲和力测定方法

从随机核酸库中筛选与靶蛋白质具有高亲和性和特异性的核酸序列是适配体筛选的最终目的。多轮筛选过程中,靶标与不同次级库的亲和力应逐渐增加,明显强于与初始核酸库的作用。多轮筛选过程中,对强结合核酸序列的筛选可通过靶标-次级库复合物的解离常数的测定进行定量评价。筛选轮次越多,解离常数越低。靶标与核酸序列以及次级库亲和力的表征通常需通过“靶标”、“靶标-核酸复合物”与“未结合核酸”的完全分离,依据其平衡浓度求算解离常数。测定方法有透析法、超滤法、凝胶电泳法、毛细管电泳法、液相色谱法等。也可不需分离,直接测定含有“靶标”、“靶标-核酸复合物”与“未结合核酸”的混合溶液。这类方法有荧光各向异性/偏振、紫外光谱法、表面等离子共振和等温滴定热量测定法等。因测定方法和条件不同,测得的解离常数也会存在差异。但解离常数可用于亲和力强弱的定性比较。

参考文献:

杨歌, 魏强, 赵新颖, 等. 蛋白质的核酸适配体筛选的研究进展. 色谱, 2016,34:370-381.

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