测量计算核酸适配体亲和力(平衡解离常数Kd值)的方法

摘 要:

细菌靶标与核酸适配体结合的亲和力是评价所筛选的适配体的重要参数。通常用靶标-核酸复合物的平衡解离常数Kd表征。Kd值越小,表明亲和力越强。当使用梯度浓度的核酸与靶标共同孵育后,检测核酸适配体-靶标复合物的浓度,按公式Y=Bmax X/(Kd + X)即可求算出Kd值。其中确定Y值的方法包括荧光成像法、荧光光谱法、流式细胞仪法、表面等离子共振法、DNA捕获元件法和ELISA法。

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细菌靶标与核酸适配体结合的亲和力和特异性是评价所筛选的适配体的重要参数。通常用靶标-核酸复合物的平衡解离常数Kd表征相互作用。Kd值越小,表明两者相互作用越强。当使用梯度浓度的核酸与靶标共同孵育后,检测核酸适配体-靶标复合物的浓度,按下述公式即可求算出Kd值。

Y=Bmax X/(Kd + X)

上述公式中:

Y:核酸适配体-靶标复合物浓度;

X:核酸浓度;

Bmax:常数。

Kd测定时可使用荧光标记的核酸。

通过测定复合物的荧光强度求算Y值,Y值的确定有多种方法:

1、荧光成像法

将荧光标记的核酸与靶标的孵育混合物经离心去除未结合的适配体后,置于荧光显微镜下观测,直接对带有荧光的成像菌体计数,可求出Y值。

2、荧光光谱法

将核酸与靶标的孵育混合物通过离心等方法分离后,使用荧光光谱仪测定核酸-靶标复合物的荧光强度,可作为Y值。

3、流式细胞仪法

将孵育混合物通过流式细胞仪, 测定带有荧光标记的核酸-靶标复合物的数量。流式细胞仪可以对复合物进行绝对定量,同时将核酸-靶标复合物与游离的核酸或靶标分离。

4、表面等离子共振法

表面等离子共振(SPR)技术将 50 μmol/L核酸固定在亲和素芯片上, 再通入109 CFU/mL的靶标细菌孵育 10min, 然后用Biacore 3000测定。结果经软件分析后可求得Kd值。由于SPR可以直接检测适配体与靶标的结合状态,因此无需额外对适配体进行修饰, 最大限度地保持了适配体的空间结构。

5DNA捕获元件(DCE)法

使用3’端带有量子点或荧光基团标记的适配体及5’端带有猝灭基团的适配体的互补序列形成双链DNA。加入靶标后,因靶标与适配体序列结合将释放出5’端携带的猝灭基团的互补序列,而使适配体上的量子点或荧光基团发光。检测荧光强度可定量检测适配体-靶标复合物的量。由于未与靶标结合的适配体的荧光被猝灭,因而此方法的背景荧光低,具有较高的灵敏度。

6、酶联适配体分析法(ELISA

将5’端标记有巯基的RNA适配体固定在银膜上,经磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱未固定的适配体后,加入靶标细菌。孵育15min后靶标被银膜上的适配体捕获固定,用PBS冲洗后,再加入带有6-羟基荧光素(FAM)标记的适配体继续孵育,使其与靶标形成适配体-细菌-适配体夹心型复合物,-洗脱未结合的适配体后,通过荧光成像即可观察到带有荧光的复合物,从而对靶标细菌进行定量分析。

参考文献:

陈尔凝, 赵新颖, 屈锋. 细菌的核酸适配体筛选的研究进展. 色谱, 2016,34(4):389-396

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