Nature microbiology:最全的猪肠道菌群参考基因集

摘 要:

猪是畜产品的主要来源,通常作为首选模式物种应用于人体多种生理功能和疾病分析。人体肠道基因集对肠道微生物和宿主生理功能间相互关系的知识起到巨大推动作用。构建一个全面的猪肠道微生物基因集是对已知猪基因组的逻辑延伸。本研究对287头猪的粪便DNA进行深度宏基因组测序,共检测到7,700,000个非冗余基因,代表719个物种。

关键词: , , ,

一、文献ID

杂志:Nature microbiology

时间:2016-9

题目:A reference gene catalogue of the pig gut microbiome

中文标题:猪肠道菌群的参考基因集

二、材料与方法

  1. 样品收集和DNA提取

分别以来自法国(110头)、丹麦(100头)和中国(87头)共11个农庄,不同年龄、不同品种(17种)、不同饮食习惯的猪作为研究对象,取直肠的新鲜粪便,立即转入液氮或干冰冷冻,-80℃保存。取200mg粪便用于DNA提取。提取时,将无菌磁珠和粪便同时放入离心管震荡2次,每次30s,震荡间歇置于冰上孵化2min。最后用Nanodrop进DNA浓度检测。

  1. DNA测序

每个样品构建一个文库,插入片段为350bp,测序策略:Illumina GAIIx、HiSeq 2000,PE100。

  1. DNA组装和基因集构建

(1)DNA组装:去除接头等低质量reads和宿主基因组DNA数据,得到平均每个样品6.13Gb,共1758 Gb高质量数据。73.7%的reads被组装成3200万个contigs,每个contigs长度均超过500个碱基,总的contig长度为45.7 GB。

(2)基因集构建:GeneMark用来预测每个样品contigs的开放性阅读框(ORFs);分别与人和小鼠进行一一比对,发现猪的肠道基因集整体平均ORF长度和组装的N50 contig长度较短。利用BLAT对所有样品基因进行成对比较构建非冗余基因集;基于NCBI-NR数据库通过CARMA3对基因进行分类;基于eggnog和KEGG数据库进行基因功能注释。

  1. 数据分析方法

(1)分类分析:属、门、种水平的物种分类、MGS分析、KEGG功能基因分析、耐药基因分析。利用Bray-Curtis距离定义样品之间的差异,并通过二维非度量多维尺度法(NMDS)进行可视化。

(2)丰度计算:基于 fitZig函数中的zero-inflated高斯混合模型进行丰度计算。通过计算Spearman相关系数获得参与柠檬酸循环的耐药基因和酶的相关性。 为鉴定猪肠道宏基因组的性别差异,本文分别对来自两个不同农场相同品种的两组猪(第一组:11头公猪,14头母猪;第二组:10头被阉割的公猪,10头母猪。两组猪饮食方式相同)进行分析,利用iPath2.0将公猪和母猪之间的差异基因或酶注释到KEGG代谢通路中。

(3)数据上传:本文获得的猪肠道宏基因组数据已存储至欧洲核苷酸档案库(European Nucleotide Archive,ENA),基因序列和相关的功能分析结果已上传至 GiGaDB数据库(http://gigadb.org/dataset/view/id/100187/token/F4CDHYruxobOKmsE)。

三、研究结果

  1. 组装及注释结果

(1)所有样品稀疏曲线和个体间基因组共有特征的比例共获得1758 Gb数据,平均每个样品6.13Gb。共检测到7 685 872个非冗余基因(NR),N50 contig平均长度为1.89kb。所有样本的稀疏曲线趋于饱和(图1a),样本中有99%的微生物基因可被捕获。

Nature microbiology:最全的猪肠道菌群参考基因集

图1. 稀疏曲线和猪中共享的基因组。(a)猪(粉色)、人(黄色)和小鼠(灰色)样品所产生的NR基因数的稀疏曲线。中国猪(CP红)、法国猪(FP蓝)、丹麦猪(DP绿色);(b)猪在不同频率阈值间所共享的微生物特征数量。基因数目(黑色)、门类(紫色),属类(橙色)、物种(棕色),MGS(蓝色),抗生素抗性基因(ARGs,绿色)和KEGG通路(红色)

(2)NR数据库比对得到的微生物基因和MGS(matagenomic species)

被分类的NR基因中,98%以上可以被划分为超级细菌界 ,剩下的2%来源于古细菌和真核生物。门水平上,大多数被注释到的基因来源于厚壁菌门微生物(28.73%), 次之来源于拟杆菌门 (9.28%)。只有7.6%的基因可注释到特定的微生物属,0.33%的基因可以注释到特定的微生物种。而人参考基因中16.3%的基因可被注释到微生物属。属水平上,被注释的基因中大多数(1.90%)来源于普氏菌属,往下依次是拟杆菌属Bacteroides (0.80%), 梭菌属Clostridium (0.79%),胃瘤球菌属Ruminococcus (0.72%) 和真细菌 Eubacterium (0.51%)。719个被注释到的MGS中,497个可被注释到已知微生物,剩下的222个代表未知微生物。353个MGS可被归为门水平微生物,但只有33个MGS被归为属水平微生物,1个被归为种水平微生物。

(3)KEGG、eggNOG 功能注释

基于KEGG和eggNOG对NR 基因和MGS进行的功能注释结果显示猪肠道微生物中遗传信息加工(复制和修复)、新城代谢(糖类、氨基酸和核苷酸)和信息传递(膜运输)等通路具有优势地位。

  1. 猪、人、小鼠丰度多样性及KO功能分析

(1)不同物种间丰度多样性分析

在基因、属和KO水平,猪的宏基因组较人和小鼠的微生物具有较高的α-多样性(图4a),较人宏基因组具有较低的β-多样性(图4b)。基因丰度、属丰度和KO丰度比人和小鼠中观察的要高(图4c)。猪、人和小鼠共有的基因在各自基因集中占的比例较低(猪0.20% ,人0.19% 和小鼠0.58%)。但基因在猪、人和小鼠两两之间也有一定重叠(猪对人, 985,734 个基因; 猪对小鼠,20,524个基因; 小鼠对人,143,375个基因)(图4d)。

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图4. 人、小鼠和猪的肠道微生物基因集比较。(a-c)α-多样性:(a)香农指数;(b)β多样性;(c)基因、KO和微生物属水平上的丰度;(d)人、小鼠和猪基因集中共有的NR基因维恩图;(e)人、小鼠和猪基因集中(90%的个体)共有的KO功能维恩图

(2)不同物种间KO功能分析

功能水平上,猪、人和小鼠的KO功能有很大比例的重叠(3,157个KO,占总KO的66.2%)(图4e),说明这3种哺乳动物具有一个功能核心,大部分是代谢、信息加工和遗传信息处理等管家功能。猪肠道宏基因组中的KO功能通路,有78%与人类是相同的,而基于人肠道宏基因组中的NR功能注释,人肠道宏基因组中有96%的KOs与猪相同,说明猪作为动物模型在人类健康和疾病中的微生物组研究中发挥着重要的作用。

  1. 宿主遗传因素对猪肠道微生物组的影响

(1)不同品种猪的肠道微生物组

选取中国6个品种且来自同一农场和同样饮食条件下的母猪作为研究对象(图6a)。基因和MGS水平上的NMDS分析将这些不同品种的母猪分为三组:1)Large White (LW)、Binary mixed (HybCN1) 和 Tertiary mixed (HybCN2);2)Bama迷你猪和BaRing猪;3)西藏猪。同样地,在KO水平,西藏猪也与其它品种猪分离开来。

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图6. 非冗余基因水平上不同品种、年龄和性别对猪肠道菌群组成影响的NMDS分析

(2)不同年龄猪的肠道微生物组

选取法国和丹麦年龄分布在55-239日龄的猪作为研究对象,基因(图6b)和KO水平上的NMDS分类结果相似。

(3)不同性别猪的肠道微生物组

选取丹麦公猪、母猪和经阉割的公猪来研究性激素对猪肠道菌群组成的影响。NMDS分析结果表明,公猪和母猪肠道菌群组成具有显著差异(图6c),而经阉割的公猪和母猪的肠道菌群组成差异不明显(图6d)。在KO水平上,公猪和母猪肠道菌群中与ABC转运蛋白、核糖体和磷酸转移酶系统相关的基因具有显著差异,而编码聚酮合酶的基因在经阉割的公猪和母猪肠道菌群中差异显著。

  1. 抗生素抗性基因分析

(1)NMDS分析将287头猪分为两组(图9a),第一组包括所有中国猪,由于持续喂养抗生素,表现出较高的抗生素抗药基因丰度(图9b)。第二组包括所有法国和丹麦的猪,未进行抗生素喂养。并且所有非冗余基因、MGS和KO功能的NMDS分析也能够将不同国家和抗生素喂养条件下的猪分开(图10)。抗杆菌肽、头孢菌素、大环内脂、抗性基因、链阳菌素B和四环素抗性基因在所有猪肠道菌群中的丰度都比较高(图9b)。而与中国猪相比,编码抗氯霉素、庆大霉素B、卡那霉素和硫磺新霉素等抗生素抗药性的基因在法国和丹麦猪肠道菌群中的丰度更低(图9b)。

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图9. 抗性基因的盛行率。(a)基于抗性基因的NMDS分析能够将中国猪、法国猪和丹麦猪分离开;(b)每头猪的抗性基因丰度信息

(2)将细菌三羧酸(TCA)酶丰度进行定量,与抗生素抗性基因丰度进行比较。结果表明,与法国和丹麦猪相比,中国猪肠道菌群中三种TCA酶(丙酮酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶和丙酮酸羧化酶)的丰度更高,并且β-内酰胺类抗生素抗性基因和编码丙酮酸脱氢酶E1基因的丰度间存在显著的相关性(r = 0.95, P < 0.001)。

四、小结

(1)本文获得了包含7,685,872个基因的猪肠道基因集,并与人类和小鼠肠道微生物组进行比较,结果表明,人类和猪肠道微生物组在基因水平有一定交集,KO功能在人类和猪肠道微生物组中的重合度非常高。并且,人类与猪肠道微生物组的相似度高于人类与小鼠肠道微生物组;

(2)本文展示了品种、性别和年龄对猪肠道菌群组成和代谢功能的影响;

(3)与禁止抗生素使用的法国和丹麦猪相比,连续喂食抗生素的中国猪肠道菌群中的抗生素抗性基因丰度更高。但总体来看,所有猪肠道菌群中存在较丰富的抗生素抗性基因。

五、展望

本文对猪肠道基因集的构建为今后的宏基因组学研究提供参考。同时,结合最近发表的猪基因组信息,我们对微生物和宿主间复杂相互作用的认识将会进一步提高。相信在未来,综合考虑表型、基因型和宏基因组数据将会成为猪养殖领域乃至整个微生物组研究中非常重要的研究手段。

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