筛选适配体时核酸库中的基团替换设计策略

摘 要:

随机核酸库通常由化学合成获得,也可以通过基因组DNA设计以及体外转录等途径获得。目前,对核酸库序列中核糖或碱基部分进行修饰, 增加随机序列二级结构多样性、ssDNA的稳定性以及对靶分子的识别能力是核酸库的设计优化策略之一。应用最多的核酸库修饰是对核糖和碱基进行基团替换。

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随机核酸库通常由化学合成获得,也可以通过基因组DNA设计以及体外转录等途径获得。筛选适配体时需设计合理的核酸库。常规的随机核酸库设计为,序列两端含引物序列,中间一般由20至60个碱基组成。如增加随机序列的长度,将使随机库中核酸分子的结构多样性呈指数级(4n,n为随机序列中的碱基个数)增长。目前,对核酸库序列中核糖或碱基部分进行修饰,增加随机序列二级结构多样性、ssDNA的稳定性以及对靶分子的识别能力是核酸库的设计优化策略之一。

应用最多的核酸库修饰是对核糖和碱基进行基团替换。如核糖2’位进行氟代、 氨基化或者甲基化等修饰。Bompiani等在2’位氟化的胞嘧啶与尿嘧啶随机库中,通过纤维素膜过滤-SELEX方法筛选获得凝血素即凝血酶前体的高亲和性RNA适配体。SAkai等对人受磷蛋白(PLN,跨膜蛋白)筛选RNA适配体时, 将RNA适配体5’端引物序列中的腺苷在氨基位进行硫代磷酸化修饰, 通过微球固定靶分子,经13轮筛选获得的适配体。

低解离率修饰适配体(Slow off-rate modified aptamers,SOMAers)来自于一种特殊酸库。将核酸中的胸腺嘧啶或尿嘧啶碱基的5’位用苄基、萘基、 色胺基或异丁基等基团取代,以增加随机库的化学多样性和对靶分子的结合能力。目前,已经有上千种蛋白质的SOMAers被筛选出来用于高通量蛋白质组分析。

锁核酸(locked nucleic acids,LNAs)含有特殊的核糖-磷酸骨架。因β-D-呋喃核糖的 2’-O、 4’-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、 硫亚甲基桥或胺亚甲基桥而连接成环形。这个环形桥锁定了呋喃糖C3’-内型的N构型,降低了核糖结构的柔韧性,却增加了磷酸骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸骨架,故其对 DNA、 RNA 有很好的识别能力和亲和力,能够在适配体中形成稳定的茎环结构。且LNA-RNA或LNA-DNA杂交双链结构具有更强的热稳定性以及抑制3’脱氧核苷酸酶的降解作用。有人将蓖麻毒素A链适配体二级结构中的茎干区域用连续的LNA代替,形成7个碱基对的双链区域,发现此种LNA修饰的适配体比原适配体对靶分子结合能力更强,同时表现出更高的热稳定性,且可防止核糖核酸酶的降解作用。增加引物区域的LNA设计对适配体稳定的二级结构的形成有促进作用,也说明引物区域参与了适配体二级结构的形成。

参考文献:

杨歌, 魏强, 赵新颖, 等. 蛋白质的核酸适配体筛选的研究进展. 色谱, 2016,34:370-381.

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