常用的适配体SELEX分离筛选技术

摘 要:

用于适配体的筛选技术有很多,如亲和层析SELEX、毛细管电泳SELEX、全细胞SELEX等。根据筛选过程中是否有序列扩增富集,可分为SELEX筛选和Non-SELEX筛选。多数适配体筛选技术属于SELEX,主要包括:建立文库、与靶物质孵育、洗脱分离、扩增富集等步骤。其中洗脱分离方法包括硝酸纤维素膜印迹法、离心沉淀法、微孔板筛选技术、磁珠分离法和柱层析分离法。

关键词: , , ,

目前,用于适配体的筛选技术有很多,如亲和层析SELEX毛细管电泳SELEX(Capillary electrophoresis SELEX)、均衡混合物的非均衡毛细管电泳SELEX(Non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures SELEX)、全细胞SELEX(whole cell-SELEX)等方法。根据筛选过程中是否有序列扩增富集,可以将现有的筛选技术分为SELEX筛选和Non-SELEX筛选两大类。大多数的适配体筛选技术属于指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),主要包括:建立文库、与靶物质孵育、洗脱分离、扩增富集等步骤。

适配体的筛选文库一般由含有15-40个随机碱基的序列组成,容量约为1013-1015,两端为固定序列,便于PCR扩增。在适配体文库与靶物质孵育阶段,研究者会根据靶物质的特点选用合适的结合缓冲液,这也是筛选过程中需要优化的条件之一。分子量不同的靶物质,其洗脱分离步骤操作差异较大,常用的分离方法主要有以下几种。

1、硝酸纤维素膜印迹法

可将靶物质固定在硝酸纤维素膜上,然后通过分子印迹分析得到能与靶物质结合的随机单链。“适配体”概念的提出者、SELEX方法的创始者Tuerk等最早应用硝酸纤维素膜筛选得到噬菌体T4 DNA聚合酶的适配体,使得该方法在适配体筛选,特别是蛋白类靶物质的筛选中得到广泛应用。Savory在筛选小鼠肝脏上某种蛋白的适配体时,借助硝酸纤维素膜完成适配体的洗脱分离步骤,该研究建立了复杂机制中靶物质的适配体筛选模型。

2、离心沉淀法

能结合上靶物质的随机单链可随靶物质一同被离心沉淀下来,该方法具有耗时短、操作简单等优点,通常用于大分子靶物质(如全菌)适配体的筛选。Hari等在筛选鼠伤寒沙门氏菌适配体时,以全菌作为靶物质,与核酸序列文库室温下共同孵育45 min后,将混合物在1 500×g下离心10 min,去除未与靶物质结合的DNA单链。经过8轮阳性筛选及2轮阴性筛选后,研究者挑选出1条能与鼠伤寒沙门氏菌特异性结合的适配体。

3、微孔板筛选技术

将靶物质加入微孔板内,经过一段时间孵育后加入核酸文库序列,能与靶物质结合的随机单链可留在微孔板上。该方法利用聚苯乙烯材料特有的吸附作用固定靶物质,稳定性较好,多用于细菌的表面大分子为靶物质的适配体筛选。Han等筛选金黄色葡萄球菌适配体时,以细菌表面的磷壁酸为靶物质,将其包被在96孔板上,加入RNA序列文库,室温下孵育20 min,用缓冲液冲洗后,能与靶物质特异性结合的RNA单链留在微孔板中,最后分离出能与金黄色葡萄球菌结合的适配体。

4、磁珠分离法

小分子靶物质可以固定在磁珠上,与适配体序列文库共同孵育后在外加磁场的作用下可以实现分离,而后通过加热或加碱等方法使适配体序列与靶物质分开。Mann等以分子量很小的乙醇胺(Mr= 61.08)为靶物质,将其固定在磁珠上。加入核酸序列文库后振荡孵育30 min,利用磁性材料的分离富集效应去除未与乙醇胺结合的核酸序列,而后加入含有尿素及EDTA的缓冲液提取结合在靶物质上的核酸序列,进入下一步扩增富集,最终筛选出6条性能良好的适配体。

5、柱层析分离法

将靶物质结合在树脂层析柱上,适配体序列文库与靶物质孵育后,能特异性结合的序列可以留在层析柱上,达到分离的目的。有人将靶物质伏马毒素B1固定在凝胶树脂亲和层析柱上,注入含有核酸序列文库的溶液,用结合缓冲液反复冲洗层析柱,成功分离出与伏马毒素B1结合解离常数为100±30 nmol/L的适配体序列。

其中,前3种方法常用于大分子靶标物质的分离,后2种方法常用于小分子靶标物质的分离。

参考文献:

解沛燕, 朱龙佼, 许文涛. 适配体在食源性致病菌检测中的应用进展. 生物技术通讯, 2016,32(4):48-62.

    A+

除注明外,本站内容由 细菌之家 原创或整理,转载请注明出处及链接。

本文永久链接: http://www.bacteria.cn/html/2016/1869.html

  • 请您留言:专业水平所限,谬误之处在所难免。如您发现不正之处,请在下面留言,谢谢!

发表评论

:?: :razz: :sad: :evil: :!: :smile: :oops: :grin: :eek: :shock: :???: :cool: :lol: :mad: :twisted: :roll: :wink: :idea: :arrow: :neutral: :cry: :mrgreen:

图片 表情