核酸适配体的筛选方法:指数富集配体系统进化技术(SELEX)

摘 要:

适配体 (Aptamer) 是经体外筛选技术得到的寡核苷酸序列,与相应的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。适配体的体外筛选过程称为指数富集配体系统进化技术 (SELEX),主要是模拟自然进化人工筛选技术。首先体外化学合成一个随机碱基数为n的单链寡核苷酸文库,随机序列的两端是PCR循环时结合引物所必需的固定序列。适配体筛选包含3个过程,分别是自发突变、自然选择、大量增殖。

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适配体 (Aptamer) 是一种经体外筛选技术得到的寡核苷酸序列 (RNA或 DNA),与相应的配体有严格的识别能力和高度的亲和力,大小一般约6-40 kDa。单链寡核苷酸,特别是RNA的一些二级结构,如发夹、茎环、假节、凸环、G-四聚体等,可使核酸分子形成多种三维结构,成为适配体与靶物质特定区域结合的基础,二者之间的结合主要通过“假碱基对”的堆积作用、氢键作用、静电作用和形状匹配等产生高特异性的结合力。适配体具有高特异性、靶分子广、易于体外合成和修饰等优点,已经在基础研究、临床诊断和治疗中显示了广阔的应用前景。

适配体的体外筛选过程称为指数富集配体系统进化技术 (Selective expansion of ligends by exponential enrichment,SELEX),主要是模拟自然进化人工筛选技术。首先体外化学合成一个随机碱基数为n的单链寡核苷酸文库,该文库则含4n个不同的寡核苷酸序列,常用的寡核苷酸随机序列含30个碱基,库容量高达430 (1018)。随机序列的两端是随后PCR循环时结合引物所必需的固定序列,由于这种随机序列,而决定了库中每条链自然形成的空间构象,即二级结构的多样性,决定了库中潜在地存在能与各种蛋白和低分子靶物质有亲和力的核酸配体。一般筛选文库的容量巨大 (可达1015左右),理论上应用SELEX技术能筛选到自然界几乎所有靶分子的适配子。

核酸适配体的筛选方法:指数富集配体系统进化技术(SELEX)

筛选过程包含和达尔文进化理论一样的3个过程,分别是自发突变、自然选择、大量增殖。一般包括几轮筛选,每轮循环包括3个主要步骤:

(1)寡核苷酸库和靶标分子孵育;

(2)寡核苷酸复合物和未结合的寡核苷酸分离;

(3)结合的序列用PCR扩增,再进入下轮的筛选过程。

通过重复上述的筛选与扩增循环,那些与靶物质不结合或与靶物质亲和力较低的DNA或RNA分子被洗掉,而与靶物质有强亲和力的DNA或RNA分子被分离出来,且纯度随SELEX过程的进行而增高,从pmol到nmol,有的甚至到µmol,最后占据库的大多数 (>90%左右),随着寡核苷酸库的逐渐富集对靶标的亲和性也增加。一般经过6-15轮的循环就可以获得特异性的适配体。

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