动物结核病诊断技术(GB/T 18645-2002)——附录D:牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定

摘 要:

本附录是标准的附录,摘自动物结核病诊断技术(GB/T 18645-2002),主要介绍了牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的鉴定,包括生化试验和动物试验的试验方法和结果判定。

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牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的鉴定,主要依据生化试验动物试验

D1 生化试验

牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的生化试验特性见下表。

生化试验类型烟酸试验Tween-80水解试验耐热接触酶试验硝酸盐还原试验尿素酶试验T2H抗性试验
生化试验类型烟酸试验Tween-80水解试验耐热接触酶试验硝酸盐还原试验尿素酶试验T2H抗性试验
牛型结核分枝杆菌----+-
禽型结核分枝杆菌--+--+
人型结核分枝杆菌+±-+++

D1.1 烟酸试验

D1.1.1 试验方法

以热蒸馏水浸泡固体培养基上的培养物15min-30min,洗下。每个培养物分装入2支试管中,每管0.4mL,再加入3%联苯胺乙醇溶液0.2mL。然后向其中一管加入10%溴化氰溶液(此液剧毒,应在通风橱内操作)0.2mL。

D1.1.2 结果判定

凡含10%溴化氰溶液的试管出现桃红色沉淀,另一管只产生无色沉淀者判为阳性;两支试管都为产生无色沉淀者判为阴性。

D1.2 吐温-80(Tween-80)水解试验

D1.2.1 试验方法

向100ml磷酸缓冲液(1/15 mol/L,pH 7.0)中加入0.5ml Tween-80、2mL 0.2%中性红溶液。经112 kPa灭菌20min,分装于试管中,每管2mL。在4°C-10°C可保存2周。

取上述试管,加入10mg/mL的菌液0.5mL,37°C培养,3d-5d观察结果。

D1.2.2 结果判定

试管内由原来的琥珀色变为桃红色或红色者判为阳性。无颜色变化为阴性。

D1.3 耐热接触酶试验

D1.3.1 试验方法

用生理盐水配制出5-10mg/mL的菌液,分装试管,每管0.5 mL,以68°C水浴20 min,冷却后加入0.5mL过氧化氢(H2O2)和Tween-80混合液(10%Tween-80加等量 30% H2O2)。观察结果。

D1.3.2 结果判定

肉眼观察,如有多量小气泡自管底升起,即为阳性。否则为阴性。

D1.4 硝酸盐还原试验

D1.4.1 试验方法

在100 mL pH7.0的磷酸盐缓冲液中,加入硝酸钠(NaNO3·H2O)85mg,经112kPa灭菌20 min后分装,每管2mL。

向上述溶液中加入10mg/mL的菌液,经37°C水浴2h后,加入1滴2倍稀释的盐酸,2滴0.2%氨苯磺胺,2滴0.1% N-甲基盐酸二氨基乙烯。在4-10°C存放2周后判断结果。

D1.4.2 结果判定

呈粉红色至紫红色者为阳性。无色或淡粉色为阴性。

D1.5 尿素酶试验

D1.5.1 试验方法

将被检材料搁尿素培养基。37°C培养。

D1.5.2 结果判定

在尿素培养基上长出结核分枝杆菌菌苔(或菌落),并且使培养基变成红色,即为阳性。培养基不变色为阴性 。

D1.6 T2H抗性试验

D1.6.1 试验方法

将被检材料接种T2H培养基和L-J培养基。37°C培养。

D1.6.2 结果判定

在上述两种培养基上长出结核分枝杆菌菌苔(或菌落)即为阳性。若在L-J培养基上生长,而在T2H培养基上不生长,则为阴性。

D2 动物试验

牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的动物试验特性见下表。

试验动物豚鼠
试验动物豚鼠
牛型结核分枝杆菌易感易感不易感
禽型结核分枝杆菌不易感易感易感
人型结核分枝杆菌易感不易感不易感

D2.1 试验方法

试验动物在试验前,应进行结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验。豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测;鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测;兔用牛型和禽型结核分枝杆菌PPD检测。

将处理过的病料约1-3mL,选用皮下、肌肉或腹腔内途径注射试验动物,每份病料至少接种2只同种试验动物。

接种后30d左右,对豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测;对鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测;对兔用牛型结核和禽型结核分枝杆菌PPD检测。如有阳性反应,可剖检其中的半数动物进行病理学观察、细菌培养和涂片镜检。另一半继续观察至3个月再剖检观察。如果为阴性反应,可于40d左右剖检其中的半数,观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检,另一半继续观察至3个月再剖检观察。

D2.2 结果判定

D2.2.1 牛型结核分枝杆菌感染

鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测阴性,无任何病变,细菌培养和涂片镜检都未见到结核分枝杆菌。同时从豚鼠和兔检测到结核分枝杆菌。或豚鼠和兔的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。

D2.2.2 禽型结核分枝杆菌感染

豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测阴性,无任何病变,细菌培养和涂片镜检都未见到结核分枝杆菌。同时,从兔和鸡检测到结核分枝杆菌或兔或鸡的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。

D2.2.3 人型结核分枝杆菌感染

仅从豚鼠检测到结核分枝杆菌。或仅豚鼠的牛结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。

本附录摘自国标——《动物结核病诊断技术(GB/T 18645-2002)

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