让QPCR的结果更加稳定可靠:设计qPCR引物的注意事项

摘 要:

Real-time PCR已是一种成熟的mRNA定量手段,Taqman探针和Sybr-Green法是常用的两种方法。其中Sybr-Green法因为使用方便、价格相对低廉而被广泛使用,引物设计是成功进行Sybr-Green法Real-time PCR检测的关键。设计qPCR引物时,需要注意以下问题:引物特异性、可变剪切、扩增效率、引物生产工艺、引物是否跨内含子、引物设计在靠近5’端还是3’端。

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Real-time PCR现已成为一种成熟的mRNA定量手段,Taqman探针和Sybr-Green法是常用的两种方法。其中,Sybr-Green法因为使用方便、价格相对低廉而被广泛使用,但是这种方法对引物的要求更高,因此,引物的设计是成功进行Sybr-Green法Real-time PCR检测的关键。很多科研人员,尤其是做临床的,做PCR实验只是一时的需要,并没有花时间去深入研究引物设计本身。

选择qPCR引物时,该注意的问题有哪些呢?

1、引物特异性

很多人以为引物特异性就是指的扩增产物单一,其实转录组相似序列的干扰也常常是造成检测假阳性的主要原因,尤其是在目标转录本表达水平较低而相似序列表达量高的情形下。对于扩增产物单一性的检测,我们需要查看熔解曲线是否单一,还要看PCR产物电泳图是否单一。如果需要保证高度单一,还可以采用Labchip进行产物分析(可以区分4bp大小的片段)。

2、可变剪切

除此之外,还要特别注意可变剪切。RNA的可变剪切可以导致产生不同的转录本,并导致翻译编码形成多种蛋白,可变剪切是调节基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制。据估计人类基因组出现可变剪切的几率高达60%。当需要检测某个特定剪接体的转录水平时,引物设计需使得扩增子限定在区别于其他剪接体的区段。否则检测到的转录水平是所有剪接体的总和而不是特定剪接体。

3、扩增效率

如果要用ΔΔCT方法进行最后的计算,就需要目的基因和内参基因有相近的扩增效率。较好的引物扩增效率应该在90%-110%,且线性回归系数R2大于0.98。

4、引物生产工艺

引物在生产的过程中一般都会有大约0.01%的错误可能(根据不同生产商,会略有差异)。除此之外,还有副产物(脱盐纯化)以及大量盐分(尤其是page纯化),虽然这不一定影响PCR实验,但是可能会导致实验不稳定。一般在临床试剂中使用的引物和探针都会尽量避免这个问题,而绝大多数科研引物都常常忽略这个问题。

5、引物是否跨内含子

在核酸抽提的过程中,抽提的RNA往往还有少量的DNA(根据不同的抽提试剂盒以及操作本身,比例不同),因此也会对实验结果产生影响。一般跨内含子的引物可以有效区分RNA和DNA样本。可以只检测RNA里的基因表达。

6、引物设计在靠近5'端还是3'

一般来说,受反转录效率和mRNA降解偏好性差异的影响,靠近3'端的引物能够更好的反映基因的表达情况。

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