噬菌体的增殖及噬菌体基因组DNA的提取

摘 要:

在实验中,常常需要利用噬菌体裂解生长的特点,培养获得大量的噬菌体颗粒,并提取噬菌体基因组DNA,下面是常用的噬菌体增殖及基因组DNA的提取方法,包括噬菌体颗粒的粗提、噬菌体基因组DNA的提取、CTAB抽提法去除基因组DNA中的多糖、部分试剂的配制和注意事项等。

关键词: ,

在实验中,常常需要利用噬菌体裂解生长的特点,培养获得大量的噬菌体颗粒,并提取噬菌体基因组DNA来开展进一步的工作,下面是常用的噬菌体增殖及基因组DNA的提取方法。

一、噬菌体粗制颗粒的提取

(1)挑宿主菌接种于100ml液体LB培养基中,37°C振荡培养至对数生长期早期。

(2)按0.1-0.01的感染复数(MOI)将噬菌体接种到对数生长期的菌液,37°C继续振荡培养过夜。

(3)在培养物中加入DNase I及RNase A至终浓度各为1μg/ml,37°C振荡30min。

(4)按1%的比例(v/v)加入氯仿,37°C振荡30min。

(5)按5.84g/100ml加入NaCl,混匀溶解,冰浴1h,10000g离心10min,去细菌碎片,收集上清。

(6)加入固体PEG 8000至终浓度10%(w/v),充分振荡溶解,冰浴1h,使噬菌体颗粒形成沉淀,4°C 12000g离心10min,弃上清。

(7)按每100ml原始菌液加2ml的比例,加入TM缓冲液重悬沉淀。

(8)加等体积氯仿,振荡30 sec,5000g离心10min,收集上层水相。

(9)再用等体积氯仿抽提1次,得到噬菌体的粗制颗粒。

二、噬菌体基因组DNA的提取

(1)在粗制的噬菌体颗粒中加入DNase I至终浓度5μg/ml,RNase A至1μg/ml,37°C水育1h,以降解残留的来源于宿主菌的核酸。

(2)加入EDTA (pH8.0)至终浓度20mmol/l,灭活DNase I。

(3)加蛋白酶K至终浓度50μg/ml,SDS至终浓度0.5%,混匀,56°C水浴1h,裂解噬菌体。

(4)加入等体积饱和酚 (pH8.0)抽提,5000g离心10min,收集上层水相。

(5)加入等体积氯仿抽提,5000g离心10min,收集上层水相。

(6)加入1/10体积3mol/l NaAc (pH5.2),再加入两倍体积的无水乙醇沉淀核酸,-20°C放置1h或过夜。4°C、12000g离心20min。

(7)沉淀分别用70%乙醇和无水乙醇洗涤一次,4°C、12000g离心10min,弃液体,室温放置晾干除去残余液体。

(8)用适量TE溶解沉淀,获得噬菌体基因组DNA样品。

三、CTAB抽提法去除基因组DNA中的多糖

(1)在600μl样品中加入100μl 5mol/l NaCl,充分混匀,再加入80μl 10% CTAB/0.7mol/l NaCl液,混匀溶解,65°C温育10min。

(2)加等体积氯仿,振荡混匀,12000g离心5min,收集上层水相。

(3)加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1),振荡混匀,12000g离心5min,收集上层水相。

(4)加入终浓度0.3mol/l NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀核酸,-20°C放置1h或过夜。

(5)4°C 12000g离心10min。

(6)沉淀分别用70%乙醇和无水乙醇洗涤一次,4°C、12000g离心10min,弃液体,室温放置晾干除去残余液体

(7)用适量TE溶解沉淀,分装后于-20°C保存备用。

四、部分试剂配制

1、SM液:NaCl 5.8g,MgSO4•7H2O 2g,1M Tris•CL(pH7.5)50ml,2%明胶 5ml,加ddH2O 至1000ml。121°C高压灭菌20min。

2、RNase A  10mg/ml,TE配制,沸水浴15min,分装后贮存于-20°C。

3、DNase I  10mg/ml,TE配制,分装后贮存于-20°C。

五、注意事项

1、用于裂解的噬菌体、宿主菌为新鲜培养获得时,裂解好、裂解噬菌体收获量大。

2、液体培养裂解时,如到培养时间时裂解尚未发生,可适当提高培养温度或加大摇震速度。

3、RNase A 、DnaseI消化不全,DNA、RNA可粘走部分噬菌体。

4、苯酚/氯仿抽提时,注意PEG、蛋白质等杂质污染,它们会影响限制性内切酶切割。

    日期:2016年04月06日  分类:噬菌体
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