中华人民共和国国家标准——动物结核病诊断技术(GB/T 18645-2002)

摘 要:

本标准规定了动物结核病的检测方法和要求,适用于动物结核病检测。本标准主要是根据世界动物卫生组织1996年颁布的《诊断试验和疫苗标准手册》中牛结核病和禽结核病部分内容制定。对其中一些在我国还无法进行的检验技术作了删减 (如淋巴细胞增生试验,γ-干扰素试验)。

关键词: , ,

1 范围

本标准规定了动物结核病的检测方法和要求。

本标准适用于动物结核病检测。

2 定义、符号和缩略语

本标准采用下列符号和缩略语:

PPD:提纯蛋白衍生物 (purifiedproteinderivative)。

IU:国际单位 (intemationalunit)。

3 细菌学检查

3.1病料的采集和处理

用于细菌学检查的材料采自淋巴结及其他组织。当活畜有可疑的呼吸道结核、乳房结核、泌尿生殖道结核、肠结核时,其痰、乳、精液、子宫分泌物、尿和粪便可作为细菌学检查的材料。

对那些结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性,但尸检时无病理学病变的动物,可从下颌、咽后、支气管、肺(特别是肺门及肺门淋巴结)、纵膈及一些肠系膜的淋巴结采集样品送检。

样品应封装在无菌的容器内冷藏运送。

为了提高检出结果,样品可采取消化浓缩法处理,处理方法见附录A(标准的附录)。

3.1.1 痰

对牛常可用痰进行细菌学检验。牛咯痰极少,它在清晨采集。用硬橡胶管自口腔伸入至气管内。外端连接注射器吸取痰液。亦可取牛咳出的痰块进行检验。

痰样品稀薄时,可加入等量的4%~6%硫酸(见附录A中A1)处理,如痰样品粘稠时,则加入5倍量的4%硫酸处理。充分摇匀后置37℃作用20min,以3000r/min~4000r/min离心,沉淀物作染色镜检、培养和动物试验。

也可用2倍量15%~20%安替福民(antiformin)溶液(见附录A中A3)处理痰液,将混合物置37℃作用1-2h后离心。以灭苗生理盐水冲洗沉淀物几次后,取沉淀物染色镜检、培养和动物试验。

3.1.2 乳

怀疑有乳房结核时,可无菌采集乳汁进行检验(一般以挤出之最后乳汁含菌量较多,早晨挤出的乳中含菌量最高)。

将乳汁分置4-6支离心管中,每管10mL,以3000-4000r/min离心20-30min,吸取上层乳脂和管底的沉淀物作染色镜检、培养和动物试验。

乳汁10mL加酒精和乙醚各10mL及15%~20%安替福民溶液30mL,摇匀置37℃恒温箱内1h~2h,取出加等量灭菌蒸馏水混匀,离心沉淀后弃去上清,取沉淀物作染色镜检、培养和动物试验。

3.1.3 精液和子宫分泌物

有生殖道结核可疑时,可采集公畜精液、母畜子宫分泌物进行细菌学检查。

处理子宫分泌物,可用15%~20%安替福民溶液,混匀后静置2h~3h,3000r/min~4000r/min离心20min,弃上清,加10mL蒸馏水于沉淀物中。即可作动物试验,经1.5~2个月剖检。

3.1.4 尿

有肾结核可疑时,可采集尿液,一般采集中段尿液,以早晨第一次尿为宜。

如仅作染色镜检,可将尿液以3000r/min~4000r/min离心20rain后,取沉淀物涂片。

如作培养或动物试验,则应将尿液进行消化浓缩处理,再进行检验以免杂菌生长而影响检验结果。

3.1.5 粪便

有肠结核可疑时,可采集粪便进行细菌学检查,患肺结核的牛只,有时在粪便中亦可检出结核分枝杆菌。因牛常将痰液吞咽至消化道内,随粪便排出。尽量采集混有粘液或脓血的粪便.

取粪便30g,加15%~20%安替福民溶液15mL和蒸馏水55mL,混合,经2h~3h后,3000r/min~4000r/min离心30min,倾去上清液,加10mL蒸馏水于沉淀物中,将此液用纱布过滤后接种于豚鼠皮下,经1.5~2个月后剖检。

或将粪便加2倍量灭菌蒸馏水磨碎,然后加氯化钠至饱和。当液体中残渣沉淀后(液体完全澄清),浮起的薄膜含有大量的结核分枝杆菌。取出薄膜,用等量的4%氢氧化钠(见附录A中A2)充分混合,置37℃中3h,然后离心,取沉淀物用8%盐酸中和后,即可作染色镜检、培养和动物试验。

粪便中如有粘液或脓血,可挑取粘液脓血选用任何一种消化液处理后检验。

如系纯粪便,取5g~10g,加生理盐水约3~4倍混合后,用细铜纱网过滤,取滤液置室温中自然沉淀,然后取上层悬液置于另一大离心管或烧杯内,加消化液约3~4倍量,置37℃温箱1h~2h,同上法处理后检验。

3.1.6 组织器官

尽量采集有结节病灶的部位。猪易患颈部淋巴结结核,亦易患肠系膜淋巴结核,且常呈钙化或干酪样病变。家禽常在肠、脾、肝发生结核病灶,有时亦可见于肺或卵巢。

病变组织需先研磨,制成乳剂,通常取组织乳剂或其他液状病料2mL~4mL,加入等量的5%氢氧化钠溶液,充分振摇5min~10min,或摇至发生液化为止,液化后经3000r/min~4000r/min离心15min~30min,沉淀物加1滴酚红作指示剂,以2mol/L盐酸中和至淡红色后,作染色镜检、培养和动物试验。

如病料为脓状或干酪状或钙化的结节病灶组织,可直接作染色镜检,往往可以检出众多的结核分枝杆菌。但得到阴性结果时,应浓缩处理后检验。

3.2 检验方法

3.2.1 染色镜检

3.2.1.1 涂片

先在玻片上涂布一层薄甘油蛋白(鸡蛋白20mL,甘油20mL,水杨酸钠0.4g,混匀)然后吸取标本滴加其上,涂布均匀。

如检验标本为乳汁等含脂肪较多的材料,在涂片制成后,可先用二甲苯或乙醚滴加覆盖于涂片之上,经摇动lmin~2min脱脂后倾去,再滴加95%酒精以除去二甲苯,待酒精挥发后即可染色。

3.2.1.2 染色

染色液配制方法见附录B(标准的附录)。

萎—尼氏抗酸染色:处理过的被检材料涂片后,经火焰固定,加苯酚复红染色液(见附录B中B1)覆盖,将玻片在火焰上加热至出现蒸汽(不能产生气泡),如此热染5min(如染色液干涸,须加适量补充)。水洗后滴加3%盐酸酒精(见附录B中B2)脱色30s~60s(至无色素脱下为止)。水洗后,以骆氏美蓝染色液(见附录B中B3)复染lmin。水洗,吸干,镜检。抗酸菌应不被盐酸酒精脱色而染成红色,其他细菌与动物细胞可被盐酸酒精脱色而均被染成蓝色。

3.2.1.3 镜检

结核分枝杆菌在显微镜下呈细长平直或微弯曲的杆菌,长1.5um~5um,宽0.2um~0.5um,在陈旧培养基上或干酪性淋巴结内的菌体,偶尔可见长达10um或更长。

3.2.2 培养

3.2.2.1 培养基配制方法见附录C(标准的附录)。

3.2.2.2 被检标本经消化浓缩后吸取其沉淀物作为培养材料。初次分离,可用配氏培养基(见附录C中C1)、L-J培养基(见附录C中C2)或青霉素血液琼脂培养基(见附录C中C3)。

3.2.2.3 将经过处理的标本接种到培养基上(同时作2~4份),培养一天后、以熔化的石蜡封口,继续培养。

3.2.2.4 牛型结核分枝杆菌比人型结核分枝杆菌生长要缓慢得多。初次培养牛型结核分枝杆菌时,需36℃-37℃培养5-8周方可出现菌落。在固定培养基上不产生任何颜色,菌落湿润、略显粗糙并发脆。加1%的丙酮酸钠能促进生长,但在噻吩-2酸肼(T2H)培养基(见附录C中C4)上不生长。

3.2.2.5 禽型结核分枝杆菌生长需要2~3周。形成湿润、弥漫状,光滑及星光状菌落。最适生长温度为40℃—42℃。在 T2H培养基上生长。

3.2.2.6 人型结核分枝杆菌生长需要36℃~37℃培养3~4周。该菌落干燥、粗糙,呈白色、黄色或橙色。牢牢附着于培养基。在T2H培养基上生长。

3.2.2.7 非典型分枝杆菌生长快速,大部分(但不是全部)产生白色或具有橙色或黄色色素,常形成黄色或橙色菌落。某些种类的色素只有在亮处才显出。大多数非典型种类的生长速度比牛或人型结核分枝杆菌快。

3.2.3 动物试验

本试验是确诊结核病的主要依据,如能与涂片镜检和培养同时进行,则结果更为可靠。

3.2.3.1 试验动物在试验前,应进行牛型结核分枝杆菌PPD和禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验。

3.2.3.2 豚鼠对牛型和人型结核分枝杆菌敏感,对禽型结核分枝杆菌有抵抗力,常只能形成局部病灶。

3.2.3.3  家兔对禽型结核分枝杆菌高度敏感。对牛型结核分枝杆菌敏感。人型结核分枝杆菌虽可使其肺部形成少量病灶,但可趋于痊愈而不致死。

3.2.3.4 处理过的病料约1-3mL,皮下或肌肉或腹腔内注射,每份病料至少接种2只同种动物。接种后30d左右,进行禽型结核分枝杆菌PPD和牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验,如有阳性反应,可剖检其中的半数动物进行病理学观察、细菌培养和涂片镜检。另一半继续观察至3个月内剖检观察。如果为阴性反应,可于40d左右剖检其中的半数,观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检,另一半继续观察至3个月再剖检观察。

3.2.4 牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定方法见附录D (提示的附录)。

4 结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验

4.1 牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验

用结核分枝杆菌PPD进行的皮内变态反应试验对检查活畜结核病是很有用的。该试验用牛型结核分枝杆菌PPD进行。

4.1.1 牛的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验

出生后20d的牛即可用本试验进行检疫。

4.1.1.1 操作方法

a)注射部位及术前处理:将牛只编号后在颈侧中部上三分之一处剪毛(或提前一天剃毛),三个月以内的犊牛,也可在肩肿部进行,直径约10cm。用卡尺测量术部中央皮皱厚度,作好记录。注意,术部应无明显的病变。

b)注射剂量:不论大小牛只,一律皮内注射0.1mL(含2000IU)。即将牛型结核分枝杆菌PPD稀释成每毫升含2万IU后,皮内注射0.1mL。冻干PPD稀释后当天用完。

c)注射方法:先以75%酒精消毒术部,然后皮内注射定量的牛型结核分枝杆菌PPD,注射后局部应出现小疱,如对注射有疑问时,应另选15cm以外的部位或对侧重作。

d)注射次数和观察反应:皮内注射后经72h判定,仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应,并以卡尺测量皮皱厚度,作好详细记录。对疑似反应牛应立即在另一侧以同一批PPD同一剂量进行第二回皮内注射,再经72h观察反应结果。

对阴性牛和疑似反应牛,于注射后96h和120h再分别观察一次,以防个别牛出现较晚的迟发型变态反应。

4.1.1.2 结果判定

  1. a) 阳性反应:局部有明显的炎性反应,皮厚差大于或等于0mm。
  2. b) 疑似反应:局部炎性反应不明显,皮厚差大于或等于0mm、小于4.0mm。
  3. c) 阴性反应:无炎性反应。皮厚差在0mm以下。

凡判定为疑似反应的牛只,于第一次检疫60d后进行复检,其结果仍为疑似反应时,经60d再复检。如仍为疑似反应,应判为阳性。

4.1.2 其他动物牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验

参照牛的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验进行。

4.2 禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验

禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验是最广泛使用于家禽的试验。牛及其他哺乳动物也可用牛型结核分枝杆菌PPD和禽型结核分枝杆菌PPD同时在不同的部位进行,以区分特异性和非特异性变态反应。

4.2.1 禽的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验

4.2.1.1 操作方法

用10mm×0.5mm针头肉垂皮内注射0.1mL(0.25万IU)禽型结核分枝杆菌PPD,48h后观察结果。

4.2.1.2 结果判定

阳性反应为接种部位肿胀,从5.0mm直径的小硬结到扩展至其他肉垂与颈部的广泛性水肿。火鸡肉垂的结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验,没有家禽的试验那样可靠。其他禽类也可用翼蹼作试验,但结果一般不理想。水禽可接种脚蹼,但试验不敏感并经常与接种部位的感染相混淆。

4.2.2 牛的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验

4.2.2.1 操作方法

与牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验相同,只是禽型结核分枝杆菌PPD的剂量为每头0.1mL。

4.2. 2. 2 结果判定

a) 对牛型结核分枝杆菌PPD的反应为阳性(局部有明显的炎性反应,皮厚差大于或等于0 mm ),并且对牛型结核分枝杆菌PPD的反应大于对禽型结核分枝杆菌PPD的反应,二者皮差在2.0 mm以上,判为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。

对已经定性为牛型结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2.0 mm以下,甚至对牛型结核分枝杆菌PPD的反应略小于对禽型结核分枝杆菌PPD的反应(反应差小于或等于2.0 mm ) ,只要对牛型结核分枝杆菌PPD的反应在2.0 mm以上,也应判定为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性牛。

b) 对禽刮结核分枝杆菌PPD的反应大于对牛型结核分枝杆菌PPD的反应,两者的皮差在2.0 mm以上,判为禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。

附录:

附录A:标本消化浓缩法

附录B:萋-尼氏抗酸染色液配制方法

附录C:培养基配制方法

附录D:牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定

 

    A+

除注明外,本站内容由 细菌之家 原创或整理,转载请注明出处及链接。

本文永久链接: http://www.bacteria.cn/html/2016/1789.html

  • 请您留言:专业水平所限,谬误之处在所难免。如您发现不正之处,请在下面留言,谢谢!

目前评论:9   其中:访客  0   博主  0   引用   9

评论加载中...

来自外部的引用: 9

  • 牛型和禽型结核分枝杆菌的结核菌素(PPD)皮内变态反应试验 – 细菌之家
  • 动物结核病诊断技术(GB/T 18645-2002)——附录B:萋-尼氏抗酸染色液配制方法 – 细菌之家
  • 动物结核病诊断技术(GB/T 18645-2002)——附录A:标本消化浓缩法 – 细菌之家
  • 动物结核病诊断技术(GB/T 18645-2002)——附录C:培养基配制方法 – 细菌之家
  • 动物结核病诊断技术(GB/T 18645-2002)——附录D:牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定 – 细菌之家
  • 牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的动物试验鉴定方法 – 细菌之家
  • 牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的生化试验鉴定方法 – 细菌之家
  • 结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验操作方法与结果判定 – 细菌之家
  • 结核分枝杆菌萋-尼氏抗酸染色方法 – 细菌之家

发表评论

:?: :razz: :sad: :evil: :!: :smile: :oops: :grin: :eek: :shock: :???: :cool: :lol: :mad: :twisted: :roll: :wink: :idea: :arrow: :neutral: :cry: :mrgreen:

图片 表情