荧光显微镜检查方法及使用注意事项

摘 要:

荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具。荧光显微镜是由超高压光源、滤板系统(包括激发和压制滤板)和光学系统等主要部件组成,是利用一定波长的光激发标本发射荧光,通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。荧光显微镜的使用应严格按照说明书进行操作,其标本制作及观察涉及到载玻片、盖玻片、标本、封裱剂、镜油等。

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(一)荧光显微镜

荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具,分透射和落射两种类型。荧光显微镜是由超高压光源、滤板系统(包括激发和压制滤板)和光学系统等主要部件组成,是利用一定波长的光激发标本发射荧光,通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。

(二)荧光显微镜标本制作要求

1、载玻片

载玻片厚度应在0.8-1.2mm之间,太厚的载玻片,一方面光吸收多,另一方面不能使激发光在标本上聚焦。载玻片必须光洁,厚度均匀,无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。

2、盖玻片

盖玻片厚度在0.17mm左右,光洁。为了加强激发光,也可用干涉盖玻片,这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片,它可以使荧光顺利通过,而反射激发光,这种反射的激发光又可激发标本。

3、标本

组织切片或其它标本不能太厚,如果太厚,激发光大部消耗在标本下部,而物镜直接观察到的上部不能充分激发。另外,细菌重叠或杂质掩盖,背景非特异性染色引起的荧光会影响结果判定。

4、封裱剂

封裱剂常用甘油,必须无自发荧光,无色透明,荧光的亮度在pH8.5-9.5时较高,不会很快褪去。所以,常用甘油和0.5mol/L pH9.0-9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作为封裱剂。如果用抗褪色剂封裱荧光染色标本更有利于显微摄影。西方是将P-次苯基二胺二氢氯100mg加入PBS 10ml中,调pH9.0-9.5,再加入甘油90ml,混匀,在室温放置过夜,待其中的气泡完全消失即可作用。

5、镜油

一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时,必须使用镜油,最好使用特制的无荧光镜油,可用甘油代替,也可用液体石蜡,只是折光率较低,对图像质量略有影响。对于落射光荧光显微镜,则无须镜油。

(三)荧光显微镜的使用注意事项

1、严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作,不要随意改变程序。

2、应在暗室中进行检查。进入暗室后,接上电源,打开超高压汞灯5-15min,待光源发出强光稳定后,眼睛完全适应暗室,再开始观察标本。

3、防止紫外线对眼睛的损害,在调整淘汰时应戴上防护眼镜。

4、检查观察时间每次以1-2h为宜,超过90min,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱;标本受紫外线照射3-5min后,荧光也明显减弱或褪色;所以连续观察最多不得超过2-3h。

5、荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,以节省时间,保护光源。天热时,应请注意降温,新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄后欲再启用时,须待灯充分冷却后才能再打开。一天中应避免数次打开光源。

6、标本染色后应立即观察,因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4°C保存,可延缓荧光减弱时间。

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