间接免疫荧光法检测细菌的实验方法和注意事项

摘 要:

间接免疫荧光染色法是利用抗球蛋白实验的原理,以荧光素标记抗球蛋白抗体,鉴定未知抗原或抗体。该法的优点是:用一种标记的抗球蛋白抗体,就能检查多种未知护抗原或抗体;本法的敏感性较高,通常比直接染色法高5-10倍。实验步骤包括标本制备、标本固定、荧光染色、洗涤、封片等,然后用荧光显微镜观察记录荧光强度。

关键词: ,

间接免疫荧光染色法是利用抗球蛋白实验的原理,以荧光素标记抗球蛋白抗体,鉴定未知抗原或抗体。染色程序分为两步:第一步,用已知抗体加到未知抗原上,作用一定时间后,水洗。第二步,加上荧光素标记的抗球蛋白抗体,如果第一步中的抗原抗体相对应,互相发生了反应,则抗体被固定,并与荧光素标记的抗球蛋白抗体结合,发出荧光。

间接免疫荧光法检测细菌的实验方法和注意事项

间接免疫荧光染色法的优点是:既能检查未知抗原,也能检查未知抗体;用一种标记的抗球蛋白抗体,就能与在种属上相同的所有动物的抗体结合,检查各种未知护抗原或抗体;另外,本法的敏感性较高,通常比直接染色法高5-10倍。

缺点是:由于参与反应的因素较多,受干扰的可能性也较大,因此结果判定有时较难;另外操作方法比较繁琐,需要做的对照较多,时间也较长。

一、试剂与仪器

(1)磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4

(2)荧光标记的抗体溶液:以0.01mol/L,pH7.4的PBS进行稀释

(3)缓冲甘油:9份分析纯无荧光的甘油+1份PBS配制

(4)荧光显微镜

(5)玻片架

(6)滤纸

(7)37°C温箱等。

二、实验方法

1、标本制备

(1)涂片标本方法:先将载玻片通过火焰3次,冷却后,以接种环(或铂金耳)挑选被检材料均匀涂布成直径约1cm的圆形涂片。如材料太浓,则应预先加适量灭菌生理盐水于另一玻片上,用接种环挑取材料与其混合稀释,待均匀后涂片,也可将生理盐水加入被检材料中,混合均匀后涂片。涂好后,自然晾干。

(2)压印标本方法:用无菌剪子将待检组织标本剪开,用无菌清洁棉球或滤纸将切面的血液吸干,然后以载玻片轻压切面,使之沾上1-2层细胞,然后再在玻片另一处以切面涂拭,得一较厚抹片,将标本自然晾干。

2、标本固定:被检标本的固定是免疫荧光技术中的重要环节,往往对荧光染色效果有明显的影响。除了研究细胞表面抗原可不固定外,一般均应先固定,然后再进行荧光抗体染色。细菌免疫荧光常用的固定剂有丙酮、10%甲醛或甲醇,固定条件为室温3-10min或4°C 30-60min。

3、将固定好的玻片标本置于湿盒中,吸取经适当稀释的免疫血清加于标本上,于37°C作用30min。

4、取出载玻片,先以PBS冲去未结合的标记抗体液,然后置大量PBS中漂洗15min,或使用去离子水或蒸馏水缓缓冲洗玻片多次后甩干,然后浸泡于PBS中1min。

5、取出载玻片,用吸水低吸干余留的液体。

6、滴加相应的抗球蛋白荧光抗体,将玻片置于带盖的不透光容器内(底部垫以滤纸,纸上放玻片架,加适量水使滤纸浸湿,玻片数量少时可用平皿,内置2-3个浸湿的棉球),密盖,放置于37°C染色30min(温度和时间根据标本情况而定)。

7、取出玻片,置玻片架上,先以PBS冲去未结合的标记抗体液,然后置大量PBS中漂洗15min,或直接在中性或偏碱性的自来水下冲洗5min,然后浸泡于PBS中1min。

8、取出玻片,用滤纸吸去多余水分,保持标本湿润,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖封片后置荧光显微镜检查。

三、结果记录

观察标本的特异性荧光强度,荧光强度用以下符号表示:

-:无荧光;

±:极弱的可疑荧光;

+:荧光较弱,但清楚可见;

++:荧光明显,呈黄绿色;

+++:荧光明亮,呈明显的绿色;

++++:荧光闪亮,呈耀眼的亮绿色。

待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为(±)或(-),即可判定为阳性。

四、注意事项

1、应设立对照实验,以排除非特异性荧光。

2、用荧光显微镜检查标本时,每次检查时间以1h为宜,超过1.5h,高压汞灯的亮度会逐渐下降,荧光减弱。此外,标本受紫外线照射15min后,荧光明显减弱,可能是荧光色素与抗体发生暂时解离所致,所以最多不得超过2-3h。

3、荧光显微镜的光源寿命有限,通常只有200h,反复开闭更能影响其寿命,帮标本应集中检查,节省时间,保护光源。灯熄后再用时,须待灯光冷却后才能再开。

4、标本染色后应立即观察,放置时间过长,荧光会逐渐减弱,若将标本放在4°C 保存,可延长荧光时间。

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