实验室提取细菌脂多糖的实验方法

摘 要:

脂多糖是细菌内毒素的主要成分,是菌株血清分型的主要依据。脂多糖由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(lipid A)组成。多糖O抗原即革兰氏阴性菌的菌体抗原(O抗原),有特异性。类脂A是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。热酚水法是提取LPS的经典方法,是基于破坏细菌细胞膜及利用苯酚析出蛋白质。此外,还包括超声波处理法和煮沸法。

关键词: , , , ,

内毒素(Endotoxin)是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态时不释放出来,只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时才表现其毒性,内毒素的主要化学成分是脂多糖(LPS)中的类脂A成分。LPS作为革兰氏阴性菌细胞壁外膜的重要组分之一,是菌株血清分型的主要依据。

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(lipid A)组成,位于最外层。多糖O抗原向外,由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链,即革兰氏阴性菌的菌体抗原(O抗原),有特异性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸(2-keto-3-deoxyoctonic acid,KDO)等组成,所有革兰氏阴性细菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位,通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物,具有致热作用,是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。

这里介绍几种细菌脂多糖的提取方法。

一、热酚水法

实验原理:

热酚水法是提取LPS的经典方法,是基于破坏细菌细胞膜及利用苯酚析出蛋白质。将细菌悬液加入热酸——水混合液中,冷却,离心。混合液可分为水溶液层(内含水溶性脂多糖及核酸等)和酸层(内含蛋白质等),近年来发现在酸层中也含糖类;沉淀中含细胞残体。

实验方法:

1、将细菌浓悬液用盐水经2500转/分,离心20分钟洗涤一次。

2、将沉淀的菌体混匀于蒸馏水中,放66℃水浴,然后滴加等量的90%热酚溶液(预热至66℃),边加边摇,而后在66℃水浴中搅拌25分钟。

3、在水浴中冷却,于4℃冰箱过夜。

4、以2000转/分离心15分钟。

5、将上层水溶液吸到另一试管中。

6、剩下的酚层及残渣组分可再加上述同量水在热水浴中搅拌30分钟,冷却,离心,取上层水溶液。

7、将两次提的水溶液混合,置透析袋中于生理盐水中透析2天,其间换几次盐水,以除去酚。

8、透析后的水溶液层经浓缩(如用聚乙二醇在透析袋外层涂抹以除去水分),即为粗制脂多糖,于冰箱内保存备用。

二、超声波处理法

1、将细菌经2500转/分,离心20分钟洗涤1-2次,将沉淀配成2倍于原始菌液浓度的浓菌液。

2、用超声波发生器中频(约相当于12000 cps)处理20分钟。

3、处理液经3000转/分,离心30分钟,吸取上清液即为脂多糖,置4℃冰箱保存备用。

三、煮沸法

1、将培养后得到的浓菌液沸水浴煮沸2小时。

2、置冰箱静置两星期以上(使菌体残渣自由下沉)。

3、3000转/分离心30分钟,取上清夜即为粗脂多糖抗原,置冰箱中保存备用。

    A+

除注明外,本站内容由 细菌之家 原创或整理,转载请注明出处及链接。

本文永久链接: http://www.bacteria.cn/html/2016/1758.html

  • 请您留言:专业水平所限,谬误之处在所难免。如您发现不正之处,请在下面留言,谢谢!

发表评论

:?: :razz: :sad: :evil: :!: :smile: :oops: :grin: :eek: :shock: :???: :cool: :lol: :mad: :twisted: :roll: :wink: :idea: :arrow: :neutral: :cry: :mrgreen:

图片 表情