异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体的方法

摘 要:

当异硫氰酸荧光素(FITC)在碱性溶液中与抗体蛋白反应时,主要是蛋白质上赖氨酸的氨基与荧光素的硫碳胺基键结合,形成FITC-蛋白质结合物,即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子最多能标记15-20个FITC分子。异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体的方法主要包括Marsshall法、Chadwick法、改良法和透析标记法。

关键词: ,

在碱性条件下,异硫氰酸荧光素(FITC)的异硫氰酸基在溶液中与抗体蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成,硫碳氨基键(thiocarbmide)结合,主要是蛋白质上赖氨酸的氨基与荧光素的硫碳胺键结合,形成FITC-蛋白质结合物,即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基,一个IgG分子最多能标记15-20个FITC分子,其反应式如下

FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 → FITC-NS-C-N-H2-蛋白质

常用Marsshall (1958)法标记荧光抗体,也可以根据条件采用Chadwick标记法或Clark等(1963)的透析标记法。

1Marsshall

(1) 材料

抗体球蛋白溶液、0.5mol/L pH9.碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素(FITC)、1%硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4°C冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7.2的0.01mol/L PBS等。

(2) 方法及步骤

① 抗体的准备:取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中,再加入生理盐水及碳酸盐缓冲液,使最后免疫球蛋白浓度为20mg/ml,碳酸盐缓冲液容量为总量的1/10,混匀,将烧瓶置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5-10min。

② 荧光素的准备:根据欲标记的蛋白质总量,按每毫克免疫球蛋白加0.01mg荧光色素,用分析天平称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。

③ 结合(或标记):边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中,避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5-10min内加完),加完后,继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4°C左右。

④ 透析:结合完毕后,将标记的球蛋白溶液离心(2500r/min) 20min,除去其中少量的沉淀物,装入透析袋中,再置于烧杯中,用pH8.0缓冲盐水透析(0-4°C)过夜。

⑤ 过柱:取透析过夜的标记物,通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G-50柱,分离游离的荧光素,收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液:0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2);过滤量:12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析);收集量:20ml(稀释1.7倍左右)。

2Chadwick

(1) 试剂和材料

抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、0.01mol/L pH8.0 PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯(25ml)搅拌器、无菌吸管,无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500ml)透析袋等。

(2) 方法及步骤

① 抗体准备:用0-4°C的pH8.0磷酸盐缓冲液将球蛋白溶液稀释至浓度为30-40mg/ml,置入25ml烧杯内,放于冰槽中。

② 荧光色素准备:按每毫克免疫球蛋白加入0.01mg荧光素,用3%重碳酸钠水溶液溶解。

③ 将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合,充分搅匀,在0-4°C冰箱中结合(最好在磁力搅拌机上持续搅拌)18-24h。

④ 透析和柱层析:方法同Marsshall法。

3、改良法

(1) 试剂和材料

① 0.01mol/L (pH7.2 )PBS。

② 0.5mol/L (pH9.0)碳酸盐缓冲液。

③ 3%重碳酸钠水溶液配法:称1.5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。

④ 其他试剂和材料:l%叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25ml)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500ml)透析袋等。

(2) 方法及步骤

① 取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清,分离球蛋白,用盐水(0.15mol/L NaCl)及缓冲液(0.5mol/L NaHCO3-Na2CO3,pH9.0)稀释使每毫升内含抗体l0mg,缓冲液为总量的10%,降温至4°C。

② 加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白:荧光素=(50-80)mg:lmg],在0-4°C下电磁搅拌12-14h。

③ 用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离,除去未结合的荧光素,再用缓冲盐水透析,除去硫酸铵 (用Nessler试剂测验,至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。

④ 将制备好的荧光抗体加叠氮化钠0.01%,分装在lml安瓿中,或冻干,保存于冰箱中(4°C)可以用半年以上,-20°C保存可达2年以上。

4、透析标记法

此法适用于小量抗体的荧光素标记,标记简便,非特异性染色较少。

(1) 试剂和材料 试剂和材料同改良法。

(2) 方法及步骤

① 用pH9.0 0.025mol/L碳酸盐缓冲液,将欲标记免疫球蛋白稀释成1%浓度,装入透析袋中。

② 用同一缓冲液将FITC配成0.1mg/ml的溶液,按10mg/ml球蛋白溶液体积的10倍,将FITC稀释液盛于圆柱形容器内,并使透析袋浸没于FITC液中。

③ 容器顶端盖紧,底部放搅拌棒,在4°C电磁搅拌下透析标记24h。取出透析袋中标记液,即刻用SephadexG50凝胶过滤,去除游离荧光素,分装,贮存于4°C中。

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