直接免疫荧光法检测细菌的实验步骤和注意事项

摘 要:

直接免疫荧光法是荧光抗体技术中最简单、最基本的一种,已被广泛用于细菌学检验,包括细菌培养物、感染组织、病畜分泌、排泄物等,该方法快速、操作简单、敏感性高。已有文献报道,应用荧光抗体技术检测沙门氏菌、霍乱弧菌、鳗弧菌等。实验步骤包括标本制备、标本固定、荧光染色、洗涤、封片,然后用荧光显微镜观察记录荧光强度。

关键词: ,

直接免疫荧光法是荧光抗体技术中最简单、最基本的一种染色法。当某种荧光抗体直接与相应的被检抗原相遇时,则发生特异性反应。直接染色法的优点是:特异性高、操作简便、比较快速。缺点是:一种标记抗体只能检查一种抗原。另外,该法的敏感性也较差。

直接免疫荧光法检测细菌的实验步骤和注意事项

直接免疫荧光技术已被广泛用于细菌学检验,标本材料可以是细菌培养物、感染组织、病畜分泌、排泄物等,相比于其它鉴定细菌的血清学方法,该方法快速、操作简单、敏感性高。已有文献报道,应用荧光抗体技术检测沙门氏菌霍乱弧菌( O1群、O139群)、兔波氏杆菌、鳗弧菌等。

一、基本原理

将荧光素标记在相应抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低,而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。

二、试剂与仪器

(1)磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4

(2)荧光标记的抗体溶液:以0.01mol/L,pH7.4的PBS进行稀释

(3)缓冲甘油:9份分析纯无荧光的甘油+1份PBS配制

(4)荧光显微镜

(5)玻片架

(6)滤纸

(7)37°C温箱等。

三、实验步骤

1、标本制备

(1)涂片标本方法:先将载玻片通过火焰3次,冷却后,以接种环(或铂金耳)挑选被检材料均匀涂布成直径约1cm的圆形涂片。如材料太浓,则应预先加适量灭菌生理盐水于另一玻片上,用接种环挑取材料与其混合稀释,待均匀后涂片,也可将生理盐水加入被检材料中,混合均匀后涂片。涂好后,自然晾干。

(2)压印标本方法:用无菌剪子将待检组织标本剪开,用无菌清洁棉球或滤纸将切面的血液吸干,然后以载玻片轻压切面,使之沾上1-2层细胞,然后再在玻片另一处以切面涂拭,得一较厚抹片,将标本自然晾干。

2、标本固定:被检标本的固定是免疫荧光技术中的重要环节,往往对荧光染色效果有明显的影响。除了研究细胞表面抗原可不固定外,一般均应先固定,然后再进行荧光抗体染色。细菌免疫荧光常用的固定剂有丙酮、10%甲醛或甲醇,固定条件为室温3-10min或4°C 30-60min。

3、将固定好的玻片标本置于湿盘中,滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待检标本片上,10min后弃去,使标本保持一定湿度。

4、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完全覆盖标本区。

5、将玻片置于带盖的不透光容器内(底部垫以滤纸,纸上放玻片架,加适量水使滤纸浸湿,玻片数量少时可用平皿,内置2-3个浸湿的棉球),密盖,放置于37°C温箱染色30min左右(温度和时间根据标本情况而定)。

6、取出玻片,置玻片架上,先以PBS冲去未结合的标记抗体液,然后置大量PBS中漂洗15min,或使用去离子水或蒸馏水缓缓冲洗玻片多次后甩干,然后浸泡于PBS中1min。

7、取出玻片,用滤纸吸去多余水分,保持标本湿润,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。

8、立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,荧光强度用以下符号表示:

-:无荧光;

±:极弱的可疑荧光;

+:荧光较弱,但清楚可见;

++:荧光明显,呈黄绿色;

+++:荧光明亮,呈明显的绿色;

++++:荧光闪亮,呈耀眼的亮绿色。

待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为(±)或(-),即可判定为阳性。

四、注意事项

1、对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的浓度,一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。

2、染色的温度和时间需要根据标本的不同而变化,染色时间可以从10 min到数小时,一般30 min已足够。染色温度多采用室温(25°C左右),37°C可加强染色效果。对不耐热抗原可采用0-2°C的低温,延长染色时间。通常低温染色过夜较37°C染色30min效果好。

3、为了保证荧光染色的准确性,首次试验时需设置以下对照,以排除非特异性荧光染色的干扰。

(1)标本自发荧光对照:不加荧光抗体,标本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。

(2)特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗体。

(3)阳性对照:已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。

4、经荧光染色的标本最好当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。

5、免疫荧光在封片时可以购买使用专用封片剂。

6、荧光抗体的孵育以及后续处理尽量避光操作。

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