免疫酶法标记用酶的特点和种类

摘 要:

免疫酶法是借助酶细胞化学等手段显示组织抗原(或抗体)的新技术,是在免疫荧光法的基础上发展起来的,其不同点是用酶代替荧光色素来标记抗体(或抗原)。能用于免疫酶法的酶并不多,最为常用的有3种:辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)和葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)。

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免疫酶法是借助酶细胞化学等手段显示组织抗原(或抗体)的新技术,是在免疫荧光法的基础上发展起来的,其不同点是用酶代替荧光色素来标记抗体(或抗原)。

从理论上讲,用细胞化学方法能显示的酶,均可用于标记抗体进行免疫酶法染色,但实际上能用于免疫组化技术的酶并不多。用于标记的酶应具备以下6个特点:

(1)酶催化的底物必需是特异的,而且容易被显示,即催化反应所形成的产物易于在光镜和电镜下观察。

(2)酶反应的终产物所形成的沉淀必须稳定,即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散,而影响组织学定位。

(3)较易获得纯的酶分子。

(4)中性PH值时,酶分子应稳定。

(5)在酶标过程中,酶连接在抗体上,不能影响二者的活性。

(6)被检组织中,不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似的物质。

上述六点中以1和2最为重要,因为并非所有的容易显示的酶均能形成不溶性的复合物。符合上述要求的,最为常用的酶是辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP),其次是碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)。除此两种外,还有葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)等,但因其形成的不溶性色素扩散作用较大,在应用上受到很大限制。

1、辣根过氧化物酶(Horseradish PeroxidaseHRP

HRP广泛分布于植物界,因其辣根含量最高而得名。它是由无色酶蛋白和深棕色的铁叶结合组成的一种糖蛋白(糖占18%左右),分子量为40kDa,等电点3-9,最适pH为5.0左右。

HRP易溶于水和58%以下的饱和硫酸铰溶液。酶的蛋白部分无活性。HRP的纯度用两者的光密度比值来衡量,以RZ(Reinheitzahi)来表示,RZ值越小,酶的纯度越差。一般认为,标记酶的RZ值为3.0左右,不应<2.8。

HRP的底物是H2O2,在反应过程中,HRP与H2O2形成初级复合物,无电子供体存在时,反应不再继续进行,当电子供体存在时,反应以一定的速度形成第二种复合物,继之HRP催化H2O2所形成的中间型产物,迅速生成水,酶被还原,电子供氢体被氧化、聚合,再经氧化环化,最后形成引哚胺多聚体,形成不溶性棕褐色沉淀,与组织对比清晰,达到定位、定性、定量的目的。

2、碱性磷酸酶(Alkaline phosphataseAKP

AKP是一种磷酸酶的水解酶,磷酸单酯酶对于连接于作用物磷酸基上的醇基没有特异性,因它可以水解多种有机磷酸酯,生成醇和磷酸盐离子。该酶在许多人体组织或动物组织中有分布,如肝、胎盘、白细胞、肾、小肠等。

AKP的分子量为80KDa,最适pH为9.8,其活性受底物及浓度、缓冲液及其离子浓度等因素影响,如用二乙醇胺缓冲液(1mol/L,pH9.8)对AICI具有活化作用,酶的活性高,而用甘氨酸-NaOH缓冲液则对AKP有抑制作用。AKP的活化剂有镁和锰离子,Mg2+的适应浓度为10mol/L。甘氨酸、柠檬酸盐、EDTA等对AKP有抑制作用。

AKP对温度具有较高的敏感性,从25°C增加到35°C,其催化反应速度增加1.5倍。

当选用不同的底物时,AKP可催化形成不同颜色的终产物。例如,萘酚-AS-MX和快蓝(Fast blue,Fh)为底物时生成蓝色产物,可与HRP催化的产物形成鲜明的对比,用快红(Fast red)代替快蓝则生成红色不溶性产物。

人体组织或动物组织中的内源性AKP较易清除,可以较好地避免内源性酶的干扰,使其具备了某些独特的优点而日益备受重视。

3、葡萄糖氧化酶(Glucose oxidaseGOD

GOD所催化的底物为葡萄糖,电子供体为对硝基蓝四隆(Paranitroblue Tetrazolium),终产物比较稳定,为不溶性的蓝色沉淀。

从理论上讲,GOD较AKP和HRP为佳,因为哺乳动物组织内不存在内源性葡萄糖氧化酶,这样可以很好地避免内源性酶的干扰。但是,GOD的分子较HRP大三倍,具有较多的氨基,在标记时易形成广泛的聚合,而影响酶的活性。

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