免疫荧光的技术原理及荧光染料的种类

摘 要:

免疫荧光技术是结合免疫学、生物化学和显微镜技术发展起来的一项技术,包括荧光抗体法和荧光抗原法。主要原理是利用抗原抗体的特异性反应和荧光素受激发光呈现特异性荧光来显示目的蛋白。具有特异性强、敏感性高、速度快等特点。常用的荧光染料有异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)和得克萨斯红等。

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免疫荧光(Immunofluorescence)技术又称荧光抗体技术,是结合免疫学、生物化学和显微镜技术发展起来的一项新技术。

一、免疫荧光的种类

荧光色素不但能与抗体结合,用于检测或定位各种抗原,也可以与其他蛋白质抗原结合,用于检测或定位抗体,因此荧光色素标记成分不同,免疫荧光技术可以分为两种:

1、荧光抗体法:用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法。

2、荧光抗原法:用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法。

但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用,所以人们习惯称为荧光抗体技术,或称为免疫荧光技术。

二、免疫荧光的原理和技术特点

1、免疫荧光技术原理

免疫荧光染色的主要原理是利用抗原-抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白。先将已知的抗体或抗原标记上荧光色素制成荧光标记物,再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受激发光的照射而呈现特异性荧光反应,可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质、定位,以及利用定量技术测定含量。

免疫荧光的技术原理及荧光染料的种类

免疫荧光技术包括直接法和间接法两种:

(1) 直接法

将标记的特异性荧光抗体,直接加在抗原标本上,经一定的温度和时间的染色,用水洗去未参加反应的多余荧光抗体,室温下干燥后封片、镜检。

(2) 间接法

如检查未知抗原,先用已知未标记的特异抗体(第一抗体)与抗原标本进行反应,用水洗去未反应的抗体,再用标记的抗抗体(第二抗体)与第一抗体反应,使之形成抗原—抗体—抗抗体复合物,再用水洗去未反应的标记抗体,干燥、封片后镜检。

2、免疫荧光技术特点

免疫荧光技术的主要特点是:特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是:非特异性染色问题尚未完全解决,结果判定的客观性不强,技术程序也还比较复杂。

由于一般荧光测定中的本底较高,因此免疫荧光技术通常用于定性分析,难以用于定量分析测定。

三、常用荧光色素(荧光染料)

许多物质都可产生荧光现象,但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能作为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光染料有:

1、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC):黄色或橙黄色结晶粉末,易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4,最大吸收光谱为490-495nm,最大发射光谱为520-530nm。FITC能和各种抗体蛋白结合,结合后的抗体不丧失与抗原结合的特异性,并在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光。FITC有两种同分异结构,其中异构体I型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好,在冷暗干燥处可保存多年,是应用最广泛的荧光素。其主要优点是:人眼对黄绿色较为敏感,通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

2、四乙基罗丹明(rhodamine,RIB200):橘红色粉末,不溶于水,易溶于酒精和丙酮。性质稳定,可长期保存。最大吸收光谱为570nm,最大发射光谱为595-600nm,呈橘红色荧光。

3、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamine isothiocyanate,TRITC):TRITC是一种紫红色粉末,较稳定。最大吸收光谱为550nm,最大发射光谱为620nm,呈橙红色荧光。与FITC的黄绿色荧光对比鲜明,可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合,但荧光效率较低。

4、得克萨斯红(texas red):得克萨斯红是一种褐色粉末,易溶于有机溶剂,性质稳定,在4°C下能保存2年以上,最大吸收光谱为590-595nm,最大发射光谱为620-630nm,共有四种结构,常用的结构分子量为625.15。

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