第三代测序技术——基于纳米孔的单分子荧光测序技术

摘 要:

第三代测序技术是基于纳米孔的单分子测序技术,真正实现了对每一条DNA分子的单独测序,有着更快的数据读取速度,应用潜能也势必超越先前的测序技术。第三代测序技术可分为单分子荧光测序技术和纳米孔测序技术。第三代单分子实时测序有三个技术关键,包括荧光标记的脱氧核苷酸、纳米微孔技术和共聚焦显微镜实时记录技术。

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第二代测序技术在制备测序文库的时候都需要经过PCR扩增,而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子的比例关系。此外,第二代测序的读长普遍偏短,在进行数据拼接时会遇到麻烦。为了克服这样的缺点,从而发展出了以单分子测序技术为标志的第三代测序技术。

第三代测序技术是基于纳米孔(nanopore)的单分子测序技术,真正实现了对每一条DNA分子的单独测序,有着更快的数据读取速度,应用潜能也势必超越先前的测序技术。第三代测序技术可分为单分子荧光测序技术和纳米孔测序技术。

试想一下,在几年前,如果有人说能用显微镜可以实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA,并用它来测序,这种想法一定会被认为异想天开。不过,现在这个想法却实现了,即第三代测序技术。

2011年,太平洋生物科学公司(Pacific biosciences,美国)面向市场推出了第一台商业化的单分子实时DNA测序(Single molecule real time DNA sequencing,SMRT)系统PacBio RS,由于其测序读长长(平均2−3 kb)、测序无偏向性等优点,但由于其测序通量较小、测序成本较高以及测序错误率较高(约15%)等因素使其在实际应用中受到了一定限制。

一、实现单分子实时测序的三个关键技术

1、荧光标记的脱氧核苷酸

现在的各种显微观测技术虽然发展得非常快,也不可能真的实时看到“单分子”。但是可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候,它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候,它的荧光基团就被DNA聚合酶切除,荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性,并且在荧光被切除之后,合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

2、纳米微孔技术

因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候,DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能完成的任务。美国太平洋生物(Pacific Bioscience)公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔(zero-mode waveguides,ZMWs),单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。在如此小的纳米孔内,DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限。A、T、C、G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去,由于dNTP在荧光信号检测区停留的时间(毫秒级)与它进入和离开的时间( 微秒级) 相比会很长,所以信号强度会很大。其它未参与合成的dNTP由于没进入荧光型号检测区而不会发出荧光,因此形成了非常稳定的背景荧光信号。而当某一种荧光标记的dNTP被掺入到DNA链时,这种特定颜色的荧光会持续一小段时间,直到新的化学键形成,荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。

第三代测序技术——基于纳米孔的单分子荧光测序技术

3、共聚焦显微镜实时记录技术

利用这种技术,可以用共聚焦显微镜实时快速地对集成在板上的无数的纳米小孔同时进行记录,从而在短时间内得到大量的测序数据。不过Pacific Biosciences公司还没有对这方面的信息进行详细介绍。

二、第三代单分子测序技术的特点

1、实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度,一秒可以测10个碱基,测序速度是化学法测序的2万倍。

2、实现了DNA聚合酶内在自身的延续性,一个反应就可以测非常长的序列。二代测序现在可以测到上百个碱基,但是三代测序现在就可以测几千个碱基。

3、精度非常高,达到99.9999%。

4、直接测RNA的序列。既然DNA聚合酶能够实时观测,那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以。RNA的直接测序,将大大降低体外逆转录产生的系统误差。

5、直接测甲基化的DNA序列。DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板,DNA聚合酶停顿的时间不同。根据不同的时间,可以判断模板的C是否甲基化。

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