最大或然数法(稀释培养计数法)进行细菌定量计数

摘 要:

最大或然数法(MPN)又称稀释培养计数法。MPN法适用于测定在一个混杂的微生物群落中不占优势,但具有特殊生理功能的类群,其特点是利用待测微生物的特殊生理功能来摆脱其他微生物类群的干扰,通过该生理功能的表现判断该微生物的存在和丰度。广泛应用于测土壤、水体等环境中氨化、硝化、反硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等特殊微生物生理类群和藻类的数量。

关键词: ,

最大或然数法(most probable number,MPN)又称稀释培养计数法,该方法是利用目的微生物特殊的生理选择性功能来对抗其他微生物的干扰,待测微生物通过其选择性的生理功能推测目的微生物在所处样品中的数量。

MPN法适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势,但却具有特殊生理功能的类群,其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰,并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。

MPN法广泛应用于测土壤、水体等环境中氨化、硝化、反硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等特殊微生物生理类群和藻类的数量,以及牛奶等食品中的特殊微生物类群(如大肠菌群)的数量,还可用于检测环境中某些基因工程菌株的数量。MPN法的缺点是只适于进行特殊生理类群的测定,结果也较粗放,而且工作量很大,只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。

MPN计数法是将待测样品做一系列梯度稀释,一直稀释到将少量(如lm1)的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖为止。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度,采用“最大或然数”理论,可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。

具体地说,菌液经多次10倍稀释后,一定量菌液中细菌可以极少或无菌,然后每个稀释度取3-5次重复接种于适宜的液体培养基中。培养后,将有菌液生长的最后3个稀释度(即临界级数)中出现细菌生长的管数作为数量指标,由最大或然数表上查出近似值,再乘以数量指标第一位数的稀释倍数,即为原菌液中的含菌数。

一、应用举例

如某一细菌在稀释法中的生长情况如下;

稀释度:                         l0-3           10-4          10-5          l0-6           10-7          10-8

重复数:                         5              5              5              5              5              5

出现生长的管数:           5              5              5              4              1              0

根据以上结果,在接种l0-3-10-5稀释液的试管中5个重复都有生长,在接种l0-6稀释液的试管中有4个重复生长,在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长,而接种10-8稀释液的试管全无生长。由此可得出其数量指标为“541”,查最大或然数表得近似值17,然后乘以第一位数的稀释倍数(10-5的稀释倍数为100 000)。那么,1ml原菌液中的活菌数=17×100 000 = 17×105。即每毫升原菌液含活菌数为1700000个。

在确定数量指标时,不管重复次数如何,都是3位数字,第一位数字必须是所有试管都生长微生物的某一稀释度的培养试管,后两位数字依次为以下两个稀释度的生长管数,如果再往下的稀释仍有生长管数,则可将此数加到前面相邻的第三位数上即可。

如某一微生物生理群稀释培养记录为:

稀释度:                         l0-1           10-2          10-3          l0-4           10-5          10-6

重复数:                         4              4              4              4              4              4

出现生长的管数:           4              4              3              2              1              0

以上情况,可将最后一个数字加到前一个数字上,即数量指标为“433”,查表得近似值为30,则每毫升原菌液中含活菌30×102个。按照重复次数的不同,最大或然数表又分为三管最大或然数表、四管最大或然数表和五管最大或然数表。

二、注意事项

在应用MPN方法计数时,应当注意以下两点:

1、要选择适当的稀释度,原则上是最低稀释度的所有平行中都应该有细菌生长,而最高稀释度中所有平行均无菌生长。

2、每个稀释度必须要做平行,平行的次数可根据需要和现实条件而定,一般3-5个平行,个别也有采用2个平行的,但平行的次数越多,误差就会越小,相对来说结果就会越准确。不同的平行次数就应按其相应的最大或然数表计算结果。

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