Red同源重组系统介导的间隙修复(gap repair)和基因抓捕(Gene-retrieval)技术

摘 要:

Gap-Repair是一种新型基因工程重组技术。在用Red同源重组系统对靶基因进行打靶时,如果线性打靶片段带有复制子和筛选标志,就可以对细菌染色体上的目的基因片段进行亚克隆,从而使线性打靶片段gap-repair,形成一个环形质粒,即基因抓捕(Gene-retrieval)。基因抓捕技术为大片段的克隆和大载体的构建提供了一种全新的设计思路和技术路线。

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近年来发展起来的Red同源重组系统,在大肠杆菌内可以很方便地对细菌染色体或人工染色体进行快速而精确的改构。Red同源重组系统由λ噬菌体exobetgam三个基因组成,可以直接利用线性打靶DNA片段进行同源重组,而且重组效率高。该系统最短只须用50-60bp的同源臂,就可实现对靶基因的点突变、插入和缺失操作。

Gap-Repair是一种新型基因重组工程技术。在用Red同源重组系统对靶基因进行线性打靶时,如果线性打靶片段带有复制子和筛选标志,就可以对细菌染色体或人工染色体上的目的基因片段进行亚克隆,从而使线性打靶片段gap-repair,形成一个环形质粒。将这种通过gap-repare方式进行的基因亚克隆称为基因抓捕(Gene-retrieval)。

基因抓捕技术为大片段的克隆和大载体的构建提供了一种全新的设计思路和可行的技术路线。Gap-Repair整个过程是在体内DNA聚合酶作用下完成,因此所克隆的目的基因完全忠实于模板DNA,不会产生任何突变。目前文献报道一次最长可抓捕到80kb的基因片段。

为了使Red重组酶系统能够方便的在细菌(如不同的大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等)中广泛应用,李山虎[2]等以Gap-Repair的方式,直接从重组工程宿主菌DY330的染色体上将6.7 kb的Red重组酶基因及其相应的调控序列克隆到质粒载体上, 获得了由pBR322携带Red重组酶基因的新型重组系统。

抓捕载体上的复制子一般采用低拷贝的复制子,如pBR322的复制子[1],它能控制每个细菌内有20个拷贝,这样既能保证抓捕载体的稳定性和容量(能够支撑49 kb的外源插入片段),也不会增加分子生物学操作的难度。抓捕载体上筛选标志的选择也很重要,当目的抓捕片段较大,不易抓捕时,用卡那霉素筛选,效果比较好。基因抓捕的难易程度除与目的抓捕片段的大小和抓捕载体有关系外,很可能还与目的基因片段所处的位置相关。

参考文献:

[1]施庚寿, 吴晓洁, 熊福银, 等. 连续三步‘Gap-repair’构建小鼠WAP-人LF杂合基因座. 生物工程学报, 2008,24(9):1538-1544.

[2] 李山虎, 洪鑫, 于梅, 等. Gap-Repair方式建立一种基于pBR322-Red的新型重组工程系统. 遗传学报, 2005,32(5):533-537.

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