生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin System,BAS)简介及应用类型

摘 要:

生物素-亲和素系统是一种非常有效的生物反应放大系统。生物素与亲和素之间具有高亲和力和多级放大效应,已成为广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测等研究的新技术。BAS用于检测的基本方法可分为四大类:标记亲和素-生物素法、桥联亲和素-生物素法、亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法和标记链霉亲和素-生物素法。

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生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin System,BAS)是上世纪70年代末发展起来的一种非常有效的生物反应放大系统。生物素-亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合。生物素-亲和素与标记试剂之间高亲和力的牢固结合及多级放大效应,使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。它已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。

生物素(biotin)为B族维生素之一,又称维生素H、维生素B7、辅酶R(Coenzyme R)等,是一种分子量为244Da的小分子维生素,广泛分布于动、植物组织中。生物素分子有两个环状结构,其中Ⅰ环为咪唑酮环,是与亲和素结合的主要部位;II环为噻吩环,C2上有一戊酸侧链,其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构。经化学修饰后,生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素。

亲和素(avidin)也称抗生物素蛋白,是一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白,分子量为68kDa,等电点pI=10.5;耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用。亲和素具有与其它示踪物质(如荧光素、酶、胶体金等)结合的能力。

一、BAS的优越性

BAS在实际应用中具有巨大的优越性,主要表现在以下几个方面:

1、生物素可与几乎所有生物大分子结合,应用广泛

活化生物素可以在蛋白质交联剂的介导下,与已知的几乎所有生物大分子偶联,包括蛋白质、核酸、多糖、脂类等。偶联后形成的生物素衍生物,不仅可保持生物大分子物质的原有生物活性,而且具有多价性,因此其应用非常广泛。

2、亲和力高,结合稳定

生物素与亲和素之间的作用是目前已知强度最高的非共价作用,亲和常数(K)为1015mol/L,比抗原与抗体间的亲和力(K=105-11mol/L)至少高1万倍。而且二者的结合稳定性好、专一性强,不受试剂浓度,pH环境,抑或蛋白变性剂等有机溶剂影响。

3、具有多级放大作用,灵敏度高

每个亲和素分子能结合4个分子的生物素,这一特点可以用于构建一个多层次信号放大系统。因此,BAS具有多级放大作用,使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。BAS可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究。

4、专一性高,非特异性干扰少

由于生物素与亲和素之间的结合具有极高的亲和力,且反应呈高度专一性。因此,BAS的多层次放大作用的提高灵敏度的同时,并不会增加非特异性干扰。而且BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响,使其有实际应用中可最大限度的降低反应试剂的非特异作用。

5、结合复合物解离常数小,呈不可逆反应性

亲和素结合生物素的亲和常数为抗原-抗体反应的百万倍,二者结合形成复合物的解离常数很小,呈不可逆反应性。而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此BAS在实际应用中,产物的稳定性高,从而提高测定的精确度。

6、生物素和亲和素均可制成多种衍生物

生物素和亲和素均可制成多种衍生物,不仅可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合,用于检测体液、组织或细胞中的抗原-抗体、激素-受体和核酸系统以及其它多种生物学反应体系,而且也可制成亲和介质,用于分离纯化上述各反应体系中的反应物。

二、BAS检测的基本方法

BAS用于检测的基本方法可分为四大类。

1、标记亲和素-生物素法(labeled avidin biotinLAB

将亲和素与标记酶(HRP)结合,一个亲和素可结合多个HRP。将生物素与抗体结合,一个抗体分子可连接多个生物素分子。抗原先与偶联了生物素的抗体结合,再将酶标亲和素结合在与抗体偶联的生物素上,如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。

2、桥联亲和素-生物素法(bridged avidin biotinBAB

先将抗原与偶联了生物素的抗体结合,再以游离亲和素为“桥”,将生物素化抗体与酶标记生物素连接,达到多层放大效果。

3、亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin biotin-peroxidase complesABC

先按一定比例将亲和素与酶标生物素(或称生物素化酶)结合,形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC复合物)。ABC复合物不能饱和,即亲和素上的4个结合位点最多允许3个与生物素化酶结合,留1-2个位点与生物素化二抗结合。抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合,最终形成巨大的复合体,因该复合体网络了大量酶分子,这一方法可以将微量抗原的信号放大成千上万倍,从而提高检测的灵敏度。

4、标记链霉亲和素-生物素法(Labelled streptavidin biotinLSAB

该法是采用生物素标记的第二抗体与结合有HRP或AKP酶的链霉亲和素连接来测定抗原。链霉亲和素与一定浓度的生物素化酶混合后,能形成链霉亲和素-生物素-酶复合物,这种复合物中至少存在1个尚未被生物素占据的链霉亲和素结合位点,可以和各种生物素标记抗体结合。由于采用了改良的亲和纯化技术和酶标技术,LSAB法敏感性更高、背景更清晰。

LSAB法的优缺点:

优点:此方法与ABC法相比,操作方法容易掌握,稳定性高,由于采用了低等电点的链霉亲和素,其内源性生物素干扰要低于ABC法。

缺点:该法最大的缺点是有内源性生物素的干扰。

    日期:2015年11月04日  分类:其 它
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