免疫荧光抗体标本的制备、固定及保存方法

摘 要:

免疫荧光标本的制备和固定方法与实验结果密切相关,标本制备中应力求保护抗原的完整性,尽量洗涤除去标本中干扰抗原抗体反应的物质。标本的固定也是免疫荧光技术中的重要环节,除了研究细胞表面抗原可不固定外,一般均应先固定,然后再进行荧光抗体染色。固定和干燥好的标本,应尽快进行染色镜检,如必须保存时,应在4°C以下干燥保存。

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免疫荧光标本的制备和固定方法与实验结果密切相关,不同的样品需要采用不同的标本制作和固定方法。免疫荧光标本的制备应力求保护抗原的完整性,并在染色、洗涤和固定过程中不发生溶解或变性,也不会扩散到邻近的细胞或组织间隙中去。此外,为了便于抗原和抗体接触,形成抗原-抗体复合物,以及有利于观察和记录,要求制备的标本尽量薄,对标本中干扰抗原-抗体反应的物质应充分洗涤除去,以免影响标本的观察及结果的判定。

一、免疫荧光标本的制备

1、病料的标本制备

这类标本在一般诊断工作中最常用,适用于检查细菌培养物、血液、脓汁、粪便、尿液、穿刺液,以及感染动物的脏器和病变组织等,均可以做成涂片或压印片标本。

(1)涂片标本方法

先将载玻片通过火焰3次,冷却后,以接种环(或铂金耳)挑选被检材料均匀涂布成直径约1cm的圆形涂片。如材料太浓,则应预先加适量灭菌生理盐水于另一玻片上,用接种环挑取材料与其混合稀释,待均匀后涂片,也可将生理盐水加入被检材料中,混合均匀后涂片。涂好后,自然晾干。

(2)压印标本方法

用无菌剪子将待检组织标本剪开,用无菌清洁棉球或滤纸将切面的血液吸干,然后以载玻片轻压切面,使之沾上1-2层细胞,然后再在玻片另一处以切面涂拭,得一较厚抹片,面积按需要而定,将标本自然晾干。

对于容易脱落的材料,如炭疽芽孢杆菌等的液体培养物或钩端螺旋体等,在压片之前,载玻片上应加入适量的粘稠物(如2-5%蛋清等),以防压印的标本脱落。

2、组织培养物标本制备

利用免疫荧光技术研究病毒时,多用组织培养的细胞。较好的方法是在细胞培养方瓶内放半片盖玻片,培养的细胞在其上生长成单层以供使用。培养的细胞一般比组织中的细胞大而薄,适用于观察细胞内特异性抗原的详细分布情况,因为能分辨出在核内或在细胞质内的抗原。特别是研究病毒在细胞内的繁殖情况时,用这种方法制备的标本比其它方法好。

二、免疫荧光标本的固定

被检标本的固定是免疫荧光技术中的重要环节,往往对荧光染色效果有明显的影响。如果所用的固定条件不同,荧光抗体染色的抗原在细胞内的分布和形态就会发生变化。所以,当解释染色效果时,要注意固定条件对结果的影响。

除了研究细胞表面抗原可不固定外,一般均应先固定,然后再进行荧光抗体染色。

1、标本固定的目的

(1)防止被检材料从玻片上脱落;

(2)清除阻止抗原抗体结合的类脂,使抗原抗体结合物易于获得良好的染色效果;

(3)固定的标本易于保存,如组织切片标本固定后,在-20°C条件下可保存一年,而不改变其染色性。

2、标本固定的原则

(1)不损伤细胞内的抗原;

(2)不损伤细胞的形态;

(3)固定后应保持细胞膜的通透性,以便于抗体和抗原结合。

3、常用的固定剂

常用的固定剂和固定时所需要的温度与时间具体见下表:

抗原种类固定剂固定条件
抗原种类固定剂固定条件
蛋白类抗原95%-100%乙醇37°C 3-10min
酶类丙酮室温15min
激素95%乙醇加1-5%冰醋酸4°C 30min
免疫球蛋白四氯化碳或95%乙醇37°C 10min,室温15min,4°C 30min
纤维蛋白95%乙醇加1-5%冰醋酸37°C 10min,室温15min,4°C 30min
病毒丙酮、四氯化碳、无水乙醇、微火加热室温5-10min,4°C 30-60min
多糖、细菌等丙酮、10%甲醛、甲醇室温3-10min,4°C 30-60min
类脂(异嗜性抗原)10%甲醛室温3-10min

由上表可以看出,根据实验目的不同,应选用不同的固定剂,如研究免疫球蛋白时,用四氯化碳比用丙酮好,因除组织内结合的球蛋白外,其它游离的球蛋白全被消除。

标本经固定后,应立即以pH7.4的PBS浸泡冲洗,程序是经过三缸浸泡,每缸3min,末次再通过pH7.4的蒸馏水脱盐,否则可能会因脂类存留,而增强自发荧光和非特异性荧光的出现。

三、免疫荧光标本的保存

固定和干燥好的标本,应尽快进行染色镜检,如必须保存时,应在4°C以下干燥保存。若保存时间长了,抗原的活性会丧失,不能被荧光抗体染色,且组织的自发荧光很强,不能使用,在室温中这种变化更快。

在低温中能放置多长时间,因抗原的种类、标本和固定方法等不同而不同。在4°C以下干燥环境中或在-20°C下保存,大致可保存1周至1个月左右。

标本保存一段时间后,其pH会发生变化(偏酸),产生阳离子,而抗体球蛋白是阴离子,结果细胞组织和抗体结合产物假阳性。为了避免这一现象,保存的标本在染色前应用pH7.6-8.0的0.01-0.02M的PBS处理,改正标本的pH值,而后进行染色。

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