Red同源重组系统pKD46质粒图谱和序列

摘 要:

目前应用最广泛的Red同源重组系统质粒是pKD46,该质粒含有受阿拉伯糖启动子调控的exo、bet、gam基因,具有氨苄青霉素抗性,其复制子为低拷贝温敏型复制子,便于质粒的消除。pKD46质粒序列全长6329 bp,详细序列见GenBank进入号:AY048746。

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pKD46质粒是目前应用最广泛的Red同源重组质粒,该质粒含有受阿拉伯糖启动子调控的exobetgam基因,具有氨苄青霉素抗性,其复制子为低拷贝温敏型复制子,便于质粒的消除。pKD46质粒序列全长6329 bp,详细序列见GenBank进入号:AY048746。

Red同源重组系统pKD46质粒图谱和序列

质粒类型:Red同源重组基因敲除载体

克隆方法:多克隆位点,限制性内切酶

拷贝数:低拷贝

载体大小:6329 bp(GenBank进入号:AY048746)

载体抗性:Ampicillin (氨苄青霉素)

备注:30°C培养

与同源重组基因敲除相关的3个酶:

1、Exo蛋白

Exo蛋白是一种核酸外切酶,单亚基的分子量为24 kD,Exo蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子,中间有一中空的通道,通道的一端可容纳双链DNA分子,另一端只可容纳单链DNA。Exo蛋白可结合在双链DNA的末端,从DNA双链的5’端向3’端降解DNA,使DNA分子形成3’粘性末端。

2、Beta蛋白

Beta蛋白在Red同源重组中起着决定性作用,具有介导互补单链DNA退火的功能,是一种退火蛋白,单亚基的分子量为25.8 kD。在溶液中,Beta蛋白自发地形成环状结构,紧紧地结合在单链DNA的3’突出端,防止DNA被单链核酸酶降解,并介导互补单链DNA的退火。双链DNA退火完成后,Beta蛋白从DNA双链上解离下来。

3、Gam蛋白

Gam蛋白为16kD的多肽分子,可与RecBCD核酸外切酶结合,抑制其对外源DNA的降解作用,防止外源DNA 进入细胞后被宿主降解。

参考文献:

[1] Datsenko KA1, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA. 2000,97(12):6640-6645.

[2] Doublet B, Douard G, Targant H, et al. Antibiotic marker modifications of lambda Red and FLP helper plasmids, pKD46 and pCP20, for inactivation of chromosomal genes using PCR products in multidrug-resistant strains. J Microbiol Methods. 2008,75(2):359-361. Doi: 10.1016/j.mimet.2008.06.010

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