Red同源重组技术方法及优缺点

摘 要:

基于Red同源重组原理,目前已有多种同源重组方法,包括两步同源重组法、双质粒基因敲除法(Gene gorging法和Gene doctoring法)和单质粒敲除法。两步同源重组法所需同源臂短,不需要构建载体,适合于常见大肠杆菌的基因敲除。Gene doctoring法具有高打靶率、高筛选率的优点。单质粒敲除法实验周期短、打靶效率较高。

关键词: , ,

一、两步同源重组

两步同源重组法是以pKD46作为同源重组质粒[1],该质粒为低拷贝温敏型质粒,具有氨苄抗性,将噬菌体exobetgam基因整合于阿拉伯糖启动子控制下;pCP20质粒含有flippase基因,表达的FLP翻转酶可以与FRT位点结合并消除抗性基因片段。

第一步,将一段含有FRT位点的抗性基因置换入宿主染色体待敲除区域。将pKD46转化入宿主菌,使其能够表达Red重组酶。然后PCR合成一段两端与目的基因同源、中间含有抗性基因的双链打靶DNA。将该片段电转化入宿主细胞。L-阿拉伯糖诱导重组酶的表达,在重组蛋白的作用下,打靶DNA与细菌染色体基因的同源处发生交换,将抗性基因置换入宿主染色体,使其获得相应抗性。复苏后抗性平板筛选得到突变子。

第二步,将质粒pCP20电转化入突变子,利用其表达的FLP翻转酶将染色体上的抗性基因敲除,得到重组框架正确的突变株。

两步同源重组法操作简单、实验周期短、打靶精确度高,是目前大肠杆菌基因敲除领域应用最为常见的方法。但该方法需要将外源DNA电转化入宿主细胞,因此对DNA片段的浓度以及感受态的效率要求较高。然而某些菌株对外源DNA的转化效率不高,进入细胞的DNA量往往不足以进行同源重组,导致两步同源重组法在某些菌株中未能成功敲除。

二、双质粒基因敲除法

双质粒基因敲除法包含一个辅助质粒和一个供体质粒。供体质粒为打靶DNA提供来源,辅助质粒含有重组酶和归巢内切酶基因。将两种质粒共转化入宿主细胞,在诱导剂的作用下,归巢内切酶切割供体质粒产生打靶DNA,重组酶促进同源基因序列完成重组。

1Gene gorging

Gene gorging法由Herring等在2003年报道,供体质粒为高拷贝质粒。通过酶切方法将打靶序列以及归巢内切酶酶切位点(I-SceI归巢内切酶识别的长18bp的特异序列)克隆于质粒上。I-SceI识别位点位于打靶序列两侧。辅助质粒pACBSR上整合了表达Red重组酶和I-SceI内切酶的基因。在阿拉伯糖诱导下,表达的I-SceI内切酶特异性切割供体质粒,产生打靶DNA。同时,Red重组酶则促进打靶DNA与宿主染色体同源序列之间的重组,实现基因敲除。

Gene gorging法不同于两步同源重组法,其打靶片段不需要外源转化,而是在宿主细胞内产生。质粒在宿主内大量复制,通过归巢内切酶的切割,导致每个细胞都产生打靶DNA,数量大大增加,提高了可能发生同源重组的细胞基数。据报道,在不使用任何筛选标记的条件下,该方法筛选到突变株的概率达到1%-15%。

Gene gorging法不依赖于外源DNA 的转化,适合于在这些菌株中进行基因敲除。

2Gene doctoring

Gene doctoring法包含供体质粒pDOC以及辅助质粒pACBSCE,原理与Gene gorging法类似,但增加了筛选条件,提高了筛选效率。

供体质粒pDOC整合了打靶基因的左右同源臂以及卡那霉素抗性基因,同源臂两侧为归巢内切酶酶切位点,此外还携带sacB基因。辅助质粒pACBSCE含有受阿拉伯糖调控的Red重组酶基因和I-SceI内切酶基因。在L-阿拉伯糖的诱导下,两种酶在细胞内表达。I-SceI内切酶切割pDOC产生线性DNA打靶片段,同时也切割pACBSCE,使该质粒逐渐消失,防止因Red重组酶的过量表达导致染色体二次修饰。在重组酶的作用下,线性打靶DNA和染色体的同源区发生交换,将卡那霉素抗性基因置换到宿主基因组上。菌液涂布于含有卡那霉素和蔗糖的LB琼脂培养基上生长,筛选重组子。sacB基因的存在,使得含有供体质粒的菌株无法在含有蔗糖的培养基上存活,因此只有携带抗性基因、并且不含质粒的重组子才能在该培养基上生长。

Gene doctoring法不仅继承了Gene gorging法高打靶效率的优点,还增加了筛选标记,在完成基因敲除的同时消除了同源重组辅助质粒,提升了筛选效率。

三、单质粒敲除法

单质粒敲除法的特点在于只需单个质粒即可完成宿主基因组的修饰,并且在染色体上不留残余序列,重组效率高。

质粒pREDI携带有2个独立的启动子[2]:一个为阿拉伯糖启动子,可诱导λ-Red重组蛋白表达,介导带标记的线性DNA打靶片段与目的基因区域的置换;另一个为鼠李糖启动子,诱导I-SceI归巢内切酶的表达,切割基因组,促进双链断裂实现分子内重组。剔除筛选标记后,完成基因组的修饰。

I-SceI归巢内切酶作用于细胞染色体上的酶切位点使DNA双链断裂,导致细胞死亡,因此只有去除了整合位点、修复了缺口、形成了正确突变结构的细胞才能存活。据报道,该方法的敲除成功率达到70%-100%。

单质粒敲除法只需单个质粒pREDI就可成功进行基因组上的突变,完成一次敲除只需要2天,而且突变菌株染色体上不留任何痕迹,相比于之前的方法有了更大的进步。

四、各种方法的优缺点

1、两步同源重组法所需同源臂短,不需要构建于载体上,非常适合应用于常见大肠杆菌的基因敲除,例如K系列菌株,对外源DNA的吸收效率较高,打靶成功率大。

2、Gene gorging法不含筛选标记,因此在某些情况下筛选工作较大、实验周期长。

3、Gene doctoring法基于Gene gorging法,具有高打靶率、高筛选率等优点,已被应用于各类致病菌的基因敲除,如出血性大肠杆菌O157:H7等,它们对外DNA吸收效率低,运用两步同源重组法很难成功。

4、单质粒敲除法实验周期短、打靶效率较高,也逐渐应用于各类大肠杆菌的基因修饰工作中。

参考文献:

[1] Doublet B, Douard G, Targant H, et al. Antibiotic marker modifications of lambda Red and FLP helper plasmids, pKD46 and pCP20, for inactivation of chromosomal genes using PCR products in multidrug-resistant strains. J Microbiol Methods. 2008,75(2):359-361. Doi: 10.1016/j.mimet.2008.06.010

[2] Yu BJ, Kang KH, Lee JH, et al. Rapid and efficient construction of markerless deletions in the Escherichia coli genome. Nucleic Acids Res. 2008,36(14):e84. Doi: 10.1093/nar/gkn359.

[3] 吕沈聪, 赵颖颖, 钟卫鸿. Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用. 化学与生物工程, 2013,30(6):1-6.

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