Red同源重组技术与自杀性载体同源重组技术的比较

摘 要:

Red同源重组技术和自杀性载体系统都可对宿主染色体进行基因修饰。有人利用肠炎沙门氏菌对对这两种技术进行比较。结果Red同源重组系统操作过程简单,但对融合PCR产物的质量要求很高,一次重组效率较低,在染色体中会残留FRT位点。自杀性载体技术需要构建长同源重组序列的载体,操作繁琐,一次重组效率高,在染色体中不留任何痕迹。

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Red同源重组技术是近年来发展起来的一种新型基因打靶技术,利用λ噬菌体Red重组酶的作用,使带有较短同源重组序列的线性DNA片段与染色体上特定的靶序列发生同源重组,靶基因被标记基因置换下来,这种重组技术可直接对宿主菌染色体进行修饰。

高效自杀性载体系统的同源重组,是20世纪80年代发展起来的染色体基因修饰技术。其基本原理是构建含一定长度同源DNA片段的重组自杀质粒,利用宿主自身的重组系统在同源重组序列交换,由于自杀性载体的性质在二次重组过程中进一步丢失上述重组质粒,最终完成重组,从而实现对宿主菌染色体的修饰。

有人利用肠炎沙门氏菌对Red同源重组技术与高效自杀性载体同源重组技术进行了比较。结果这两种方法都能对肠炎沙门氏菌染色体进行直接修饰,而且都无抗性选择标志的残留。但是在实际操作和效率上这两个系统存在较大的差异:

Red同源重组系统中融合PCR产物直接和肠炎沙门氏菌染色体上的靶基因之间发生了外源基因参与的同源重组,这一过程对融合PCR产物的质量要求很高,而且感受态细胞中必须含有pKD46质粒,在制作感受态细胞的过程中要对Gam、Beta和Exo这3个λ噬菌体重组酶进行阿拉伯糖诱导,一次重组效率极低,100ng纯化PCR产物电转化至含pKD46质粒的标准株50336能获得1个重组子,但每次电转化操作不一定都能获得重组子。

自杀性载体系统是将构建好的重组质粒转化宿主菌,其一次重组效率高,50ng重组质粒相对可以获得10个重组子左右,二次重组也只需蔗糖传代筛选敲除抗性质粒。

敲除基因在染色体中的残留:Red同源重组系统将在染色体中残留FRT位点;而自杀性载体系统在染色体中不留任何痕迹。总体来说,Red同源重组系统构建突变株时一次重组效率偏低,但其操作过程简单,只要将PCR产物转化受体菌即可获得突变株,省时省力;在高效自杀性载体系统中,需要构建长同源重组序列的载体,要经过多次酶切连接,操作繁琐。

参考文献:

朱春红, 孙晓庆, 何素芬, 等. 基于Red同源重组和高效自杀性载体系统构建肠炎沙门氏菌突变株方法的比较. 中国预防兽医学报, 2009,31(2):81-84.

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