Red同源重组系统的组成及技术原理

摘 要:

Red同源重组技术具有同源序列短(40-60bp)、重组效率高的特点,可在基因组的任意位点进行基因敲除、插入、点突变等。Red系统由λ噬菌体的exo、bet、gam三个基因组成。Exo蛋白是核酸外切酶,能使DNA分子形成3’粘性末端。Beta蛋白介导互补单链DNA退火。Gam蛋白可防止外源DNA被宿主降解。目前应用最广泛的Red系统是pKD46质粒。

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Red同源重组技术的原理是将一段携带与靶基因两侧各有35-60bp同源序列的DNA片段导入宿主菌,利用λ噬菌体Red重组酶的作用,使导入细胞的线性DNA片段与基因组的特定靶序列进行同源重组,靶基因被标记基因置换下来。

Red同源重组技术是一项可在染色体水平上进行遗传操作的技术,只需较短的同源序列,而不需要特定的限制性酶切位点,即可在生物体内完成重组过程,省去了体外DNA酶切、连接等步骤。通过Red重组技术,在靶基因两侧序列已知的条件下就可以对该基因进行敲除、插入、点突变等操作。将含有ori复制序列的线性载体片段导入细胞,还可将靶基因克隆于载体上。

一、Red同源重组系统组成

Red同源重组系统由λ噬菌体exobetgam三个基因组成,它们分别编码Exo、Beta、Gam三种蛋白质。

1、Exo蛋白

Exo蛋白是一种核酸外切酶,单亚基的分子量为24 kD,Exo蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子,中间有一中空的通道,通道的一端可容纳双链DNA分子,另一端只可容纳单链DNA。Exo蛋白可结合在双链DNA的末端,从DNA双链的5’端向3’端降解DNA,使DNA分子形成3’粘性末端

2、Beta蛋白

Beta蛋白在Red同源重组中起着决定性作用,具有介导互补单链DNA退火的功能,是一种退火蛋白,单亚基的分子量为25.8 kD。在溶液中,Beta蛋白自发地形成环状结构,紧紧地结合在单链DNA的3’突出端,防止DNA被单链核酸酶降解,并介导互补单链DNA的退火。双链DNA退火完成后,Beta蛋白从DNA双链上解离下来。

3、Gam蛋白

Gam蛋白为16kD的多肽分子,可与RecBCD核酸外切酶结合,抑制其对外源DNA的降解作用,防止外源DNA 进入细胞后被宿主降解。

4、重组机制

当Beta蛋白与单链DNA的3’突出端结合形成复合体后,重组机制分为两种:若参与重组的另一同源序列为双螺旋DNA链,Beta蛋白结合的单链DNA在RecA蛋白的作用下侵入双链DNA,完成重组过程,这一机制称为链侵入(strand invasion)模型;若另一同源序列为单链DNA,Beta蛋白介导互补单链DNA退火,完成重组过程,这一机制称为单链退火(single strand annealing)模型。

Red同源重组系统的组成及技术原理

大肠杆菌RecA重组机制不同的是,Red同源重组不存在对RecA蛋白的绝对依赖性,避免了RecA蛋白引起的基因重排和随机重组,并且重组效率远高于RecA重组。

二、Red同源重组质粒pKD46

目前应用最广泛的Red同源重组系统是Datsenko等构建的pKD46[1],该质粒含有受阿拉伯糖启动子调控的exobetgam基因,具有氨苄抗性,其复制子为低拷贝温敏型复制子,便于质粒的消除。

三、Red同源重组应用的宿主

Red系统不仅可以用于大肠杆菌靶基因的敲除,还能应用于其它细菌病毒靶基因的敲除。有研究将Red系统应用于痢疾志贺氏菌、棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒等。由此说明,在一定的实验条件下,Red重组系统一样可以在大肠杆菌以外的微生物中应用。

参考文献:

[1] Doublet B, Douard G, Targant H, et al. Antibiotic marker modifications of lambda Red and FLP helper plasmids, pKD46 and pCP20, for inactivation of chromosomal genes using PCR products in multidrug-resistant strains. J Microbiol Methods. 2008,75(2):359-361. Doi: 10.1016/j.mimet.2008.06.010

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