酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)

摘 要:

酵母人工染色体是一种穿梭克隆载体,在结构上模拟酵母染色体的线状DNA分子,可以克隆400Kb的DNA片段,含有质粒克隆载体所必备的第一受体大肠杆菌的质粒复制起始位点(ori)和第二受体酵母染色体必需的功能元件,包括着丝点、复制起始位点和端粒。YAC载体主要用来构建大片段DNA文库,尤其是构建高等真核生物的基因组文库。

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一、酵母人工染色体的概念

酵母人工染色体(Yeast artificial chromosomes,YAC)是一种穿梭克隆载体,可以克隆长达400Kb的DNA片段,含有质粒克隆载体所必备的第一受体大肠杆菌的质粒复制起始位点(ori),还含有第二受体酵母天然染色体所必需的功能元件,包括两个端粒、一个着丝点和一个DNA复制起始位点。

YAC载体在第一受体大肠杆菌细胞内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制。将载体在体外与目的DNA片段重组后,转化第二受体酵母细胞,可在酵母细胞内按染色体DNA复制的形式进行复制。筛选第一受体的克隆子,一般采用抗菌素抗性选择标记;而筛选第二受体的克隆子,常用与受体互补的营养缺陷型。

二、YAC载体的核心组成元件

YAC载体的复制元件是其核心组成元件,其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列,即自主复制序列(autonomously replicating sequence,ARS)、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒(centromere,CEN)和两个端粒(TEL)。

YAC载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要,必须含有以下元件:

(1)端粒重复序列(telomeric repeat,TEL):定位于染色体末端的一段序列,用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解,以形成稳定的结构。

(2)着丝粒(centromere,CEN):有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点,使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如pYAC4使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。

(3)自主复制序列(autonomously replication sequences,ARS):一段特殊的序列,含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号。

(4)标记基因。YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因,如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因trp1leu2his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等,以及赭石突变抑制基因sup4。与YAC载体配套工作的宿主酵母菌(如AB1380)的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基础培养基上形成红色菌落,当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时,可抑制ade 2-1基因的突变效应,形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象,可用于筛选载体中含有外源DNA片段插入的重组子。

三、YAC载体的工作原理

YAC 在结构上能模拟酵母染色体的线状DNA分子。将大片段的基因组DNA连接到YAC载体的两个“臂”上,然后将连接产物通过转化的方法导入酵母菌,这样就构成了重组的YAC。每一条臂分子中都携带一个选择标记以及按适当方向排列的起端粒作用的DNA序列。另外,其中一条臂上还携带着丝粒DNA序列以及复制子序列。因此在重组的YAC中,外源基因组DNA片段的一侧为着丝粒、复制子及选择标记,另一侧为第二种选择标记。通过在选择性琼脂平板上生长的菌落可鉴定出已转化并稳定保持人工染色体的酵母转化子。

在 YAC载体中最常用的是pYAC4。由于酵母的染色体是线状的,因此其在工作状态也是线状的。但是,为了方便制备YAC载体,YAC载体以环状的方式存在,并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记,以便保存和增殖。

YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库,特别用来构建高等真核生物的基因组文库,并不用作常规的基因克隆。下图是以pYAC4为例如,当用BamHI切割成线状后,就形成了一个微型酵母染色体,包含染色体复制的必要顺式元件,如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒。对于BamHI切割后形成的微型酵母染色体,当用EcoRI或SmaI切割抑制基因sup4内部的位点后形成染色体的两条臂,与外源大片段DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体,通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制,并随细胞分裂分配到子细胞中去,达到克隆大片段DNA的目的。

酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)

装载了外源DNA片段的重组子导致抑制基因sup4插入失活,从而形成红色菌落;而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源DNA片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了YAC文库。

四、YAC载体的优缺点

YAC载体虽然功能强大,但有一些缺点,主要表现在3 个方面:

(1)在YAC载体的插入片段会出现缺失(deletion)和基因重排(rearrangement)现象。

(2)容易形成嵌合体。嵌合就是在单个YAC中的插入片段由2个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的5-50%。

(3)YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近,影响了YAC载体的广泛应用。YAC染色体一旦进入酿酒酵母细胞,由于其大小与内源的染色体的大小相近,就很难从中分离出来,不利于进一步分析。

但是YAC载体也具有一些突出的优点:

(1)容量大。YAC文库装载的DNA片段的大小一般可达200-500kb,有的可达1Mb以上,甚至达到2Mb。大片段的DNA序列插入更有可能包含完整的功能基因,在染色体步移中每次允许更大的步移距离,同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。

(2)稳定性好。酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的DNA有更强的容忍性。

(3)功能基因组研究的有力工具。YAC在功能基因和基因组研究中是一个非常有用的工具。由于高等真核生物的基因大多数是多外显子结构并且有长长的内含子,大型基因组片段可通过YAC载体转移到动物或动物细胞系中,进行功能研究。

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