沙土管保藏法保存菌种的原理和方法

摘 要:

沙土管保藏法是将待保藏菌种制成孢子悬液,将悬液滴入灭菌的沙土管中,再经干燥密封后置于4°C冰箱中保藏。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖,延长保藏时间。本方法适用于产孢子类放线菌、芽孢杆菌、曲霉属、青霉属及少数酵母,保藏时间约为2-10年不等。沙土管保藏法应用于营养细胞则效果不佳。

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沙土管保藏法先将待保藏菌种接种于斜面培养基上,经培养后制成孢子悬液,将孢子悬液滴入已灭菌的沙土管中,孢子即吸附在沙子上,将沙土管置于真空干燥器中,吸干沙土管中的水分,经密封后置于4°C冰箱中保藏。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖,从而延长保藏时间。

一、适用范围

本方法适用于产孢子类放线菌、芽孢杆菌、曲霉属、青霉属及少数酵母,如隐球菌酵母和红酵母等,保藏时间约为2-10年不等。但该法应用于营养细胞则效果不佳,不适用于病原性真菌的保藏,特别是不适于以菌丝发育为主的真菌的保藏。

二、保藏方法

1、沙土管的制备

(1)取河沙加入10%稀盐酸,浸泡24h(或加热煮沸30分钟),以去除其中的有机质。如河沙中有机质较多,可用20%盐酸。

(2)倒去酸水,用自来水浸泡并冲洗至中性。

(3)烘干,用40目筛子过筛,以去掉粗颗粒,备用。

(4)另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土,加自来水浸泡洗涤数次,直至中性。

(5)烘干,碾碎,通过100目筛子过筛,以去除粗颗粒。

(6)按沙:土=2:1或3:1的比例(也可根据需要用其他比例,甚至可全部用沙或全部用土)掺合均匀,分装入10×100mm的小试管或安瓿管中,每管装1g左右,塞上棉塞,灭菌,烘干。

(7)抽样进行无菌检查,每10支沙土管抽一支,将沙土倒入肉汤培养基中,37°C培养48小时,若仍有杂菌,则需全部重新灭菌,再作无菌试验,直至证明无菌,方可备用。

2、菌悬液的制备

(1)选择培养成熟的(一般指孢子层生长丰满的,营养细胞用此法效果不好)优良菌种,向斜面培养物中加入3-5ml无菌水,洗下细胞或孢子,制成悬液。

(2)于每支沙土管中加入约0.2-0.5ml(一般以刚刚使沙土润湿为宜)悬液,拌匀。

(3)放线菌和霉菌可直接挑聚孢子拌入沙土管中。

3、干燥

将拌匀的沙土管放入真空干燥器内,用真空泵抽干水分,抽干时间越短越好,尽量在12小时内抽干。

4、菌种检查

(1)每10支抽取一支,无菌条件下用接种环取出少量沙土粒,接种于斜面培养基上,进行培养,观察生长情况和有无细菌生长。

(2)如出现杂菌或菌落数很少或根本不长,则说明制备的沙土管不合格,需重新制备。

(3)若经检查没有问题,用火焰熔封管口,放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。用此方法,通常可以保藏2-10年时间不等。

5、复苏

需要使用菌种复活培养时,在无菌条件下打开沙土管,取沙土少许移入适宜的培养基内,置适宜的条件下培养。

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