中科院开发出CRISPR-Cas9系统一步克隆大基因簇技术(CATCH)

摘 要:

大片段基因簇的克隆是微生物功能基因组研究中最为基础和关键的方法,也是目前功能基因组研究的难点之一,开发一种快速简单的方法来获得大尺度基因簇片段至关重要。中科院微生物所等机构开发了利用CRISPR-Cas9系统一步靶向克隆上百kb基因簇片段的方法。该技术的成功,将大大促进功能基因组学的研究,以及其它需要进行大片段克隆的研究。

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大片段基因簇(尤其是高附加值生物分子的基因簇)的克隆是微生物功能基因组研究中最为基础和关键的方法,这也是目前功能基因组研究的难点之一。传统基于PCR的克隆方法或者通过构建基因组文库筛选等方法存在着克隆片段长度的限制、易产生突变、步骤复杂、效率低下等缺点,并不适合大片段基因组的克隆。因此开发一种快速简单的方法来获得大尺度的基因簇片段至关重要,这也是目前许多实验室的课题之一。

近日,中科院微生物所娄春波课题组与清华大学、特拉维夫大学合作开发了利用CRISPR-Cas9系统一步靶向克隆上百kb基因簇片段的方法。CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) /Cas (CRISPR-associated) 是近年出现的一种由RNA介导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。它是细菌古细菌为应对病毒和质粒的不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。

该系统的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA) 结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物,此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点处剪切双链 DNA,从而实现对基因组DNA序列进行编辑;而通过人工设计这两种 RNA,可以改造形成具有引导作用的gRNA (guide RNA),足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及RNA,这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。

基于CRISPR-Cas9系统的原理,研究人员利用RNA介导的CRISPR-Cas9核酸内切酶精确的切割所需克隆的任意基因簇片段两侧,并通过Gibson组装方法将切割下来的大片段与目标载体进行连接,达到一步克隆的目的。利用该方法成功克隆了不同尺度(50-150 kb)的大肠杆菌基因组片段,并在其他细菌(枯草芽孢杆菌、链霉菌)中成功克隆了芽孢、金霉素、杰多霉素等生物合成基因簇。

该技术的成功,将大大促进功能基因组学的研究,以及其它需要进行大片段克隆的研究。目前,该技术已于2015年9月1日在Nature Communications 杂志在线发表,文章第一作者是清华大学博士生姜文君,微生物所赵学金博士做出了前期领先的重要贡献,并已经与合作单位联合申请了国际专利及国内专利。

中科院开发出CRISPR-Cas9系统一步克隆大基因簇技术(CATCH)

图一 CATCH技术示意图

中科院开发出CRISPR-Cas9系统一步克隆大基因簇技术(CATCH)

图二 应用CATCH技术克隆芽孢(a),杰多霉素(b),金霉素(c)生物合成基因簇鉴定结果

参考文献:

Jiang W, Zhao X, Gabrieli T, et al. Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments CATCH enables one-step targeted cloning of large gene clusters. Nat Commun. 2015,6:8101. doi: 10.1038/ncomms9101.

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