平板稀释计数法进行细菌活菌计数

摘 要:

稀释平板计数又称活菌计数,是根据细菌在固体培养基上形成一个菌落即代表一个单细胞(细菌)而设计。计数时,首先将待测样品制成10倍系列梯度稀释液,再取一定量的稀释液接种到平板中。培养后,统计菌落数目,即可计算出样品中的细菌数。一般用于某些成品检定(如杀虫菌剂等)、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。

关键词: ,

一、平板计数法的原理

稀释平板计数是根据细菌在固体培养基上所形成的单个菌落,即是由一个单细菌细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法,即一个菌落代表一个单细胞(细菌)。

计数时,首先将待测样品制成均匀的10倍系列梯度稀释液,尽量使样品中的细菌分散开,使成单个细胞存在(否则一个菌落就不只是代表一个细胞),再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中,使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可计算出样品中的细菌数。

此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数,故又称活菌计数。一般用于某些成品检定(如杀虫菌剂等)、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。

二、实验器材

1、活材料:苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌或培养好的大肠杆菌菌液

2、培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB琼脂平板培养基

3、器材:稀释用无菌水、无菌平皿、无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃棒等。

三、实验方法

1、细菌样品系列稀释液的制备

(1)准确称取待测样品l0g,放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中,用手或置摇床上振荡20 min,使微生物细胞分散,静置20-30s,即成10-1稀释液;

如果为液体样品(如培养好的大肠杆菌菌液),则吸取100μl菌液放入装有900μl无菌水的离心管中,混匀,即成10-1稀释液;

(2)再吸取10-1稀释液100μl,移入装有900μl无菌水的试管中,吹吸3次,让菌液混合均匀,即成10-2稀释液;

(3)再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液100μl,移入装有900μl无菌水的试管中,吹吸3次,即成10-3稀释液;

(4)以此类推,连续进行10倍梯度稀释,制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液。

用稀释平板计数时,待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时,稀释度应高,反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时,采用10-7、10-8、10-9稀释度,测定土壤细菌数量时,采用10-4、10-5、10-6稀释度,测定放线菌数量时,采用l0-3、10-4、10-5稀释度,测定真菌数量时,采用10-2、10-3、10-4稀释度。

2、平板接种培养

平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法,常用的是涂抹平板培养法。

(1)混合平板培养法

将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码,每一号码设置3平板个重复,用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中,同法吸取10-8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中,再吸取10-7稀释液各lml放入编号10-7的3个平板中(由低浓度向高浓度时,吸管可不必更换)。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45-50°C的细菌培养基,轻轻转动平板,使菌液与培养基混合均匀,冷疑后倒置,适温培养。至长出菌落后即可计数。

(2)涂抹平板计数法

涂抹平板计数法与混合法基本相同,所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上(每个编号设3个重复)。再用无菌玻璃棒将菌液在平板上涂抹均匀,更换稀释度时需将玻璃棒灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时,也可不对玻璃棒灼烧灭菌。将涂抹好的平板平放于桌上20-30min,使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,保温培养,至长出菌落后即可计数。

四、实验记录

将实验结果填入下表中

平板稀释计数法进行细菌活菌计数

计算结果时,常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度,求出每克菌剂中的含菌数。

(1)同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。

(2)细菌、放线菌、酵母菌以每平板30-300个菌落为宜,霉菌以每平板10-100个菌落为宜。

五、活菌计数

选择好计数的稀释度后,即可统计在平板上长出的菌落数,统计结果按下式计算。

(1)混合平板计数法:

每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数

(2)涂抹平板计效法:

每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数

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