K-B纸片扩散法药敏试验的标准操作程序(SOP)

摘 要:

目前药敏试验的方法主要有:Kirby-Bauer法(K-B纸片扩散法)、稀释法、E test法以及全自动微生物分析仪进行药敏测试。其中由Kirby和Bauer所建立的K-B纸片扩散法是各国临床微生物学实验室广泛采用的药敏试验方法。我国于1995年开始采用NCCLS 1993年和1994年关于药敏纸片法文件中的实验方法,实现了耐药监测方法的标准化。

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细菌的耐药性和抗生素的合理使用是全球广泛关注的问题。其中细菌对抗生素敏感试验(以下简称药敏试验)在延缓和控制细菌耐药性、合理使用抗生素方面发挥着重要作用。它能对抗生素临床治疗的效果进行预测、监测耐药量、减少治疗错误。目前药敏试验的方法主要有:Kirby-Bauer法(以下简称K-B纸片扩散法)、稀释法、E test法以及运用全自动微生物分析仪(Vitek、Microscan、Sensititre ARIS、ATB等)进行药敏测试。其中由Bauer和Kirby所建立的纸片琼脂扩散法,即K-B纸片扩散法是各国临床微生物学实验室广泛采用的药敏试验方法 。

1993年美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)法规指出,K-B纸片扩散法适用于快速生长的细菌,它们包括肠杆菌科、葡萄球菌科、假单胞菌属、不动杆菌属、产单核细胞李斯特菌和某些链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎球菌等稍加修改也同样适用,但对苛养菌、厌氧菌、真菌、分枝杆菌等应遵照NCCLS的其他文件规定进行药敏试验。我国于1995年开始采用NCCLS 1993年和1994年关于药敏纸片法文件中的实验方法,实现了国内耐药监测方法的标准化。

一、试验目的

保证纸片扩散法药敏结果的可靠性。

二、试验材料

(一)培养基

1、Mueller-Hinton琼脂平板:只适合肠杆菌科、铜绿假单胞菌、不动杆菌、葡萄球菌、肠球菌、霍乱弧菌

2、HTM琼脂:只适合嗜血杆菌。

3、GC琼脂+1%特定的生长因子:只适合淋病奈瑟菌。

4、Mueller-Hinton琼脂+5%羊血:只适合链球菌。

(二)药敏纸片

抗菌药物纸片直径约为6.0-6.35mm,厚度约1mm,每片的吸水量约20μl。

(三)质控菌株

K-B法质量控制用菌株常规用:金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。

(四)菌液比浊管

接种菌液浓度为1.5×108CFU/ml,相当于0.5麦氏比浊管。

三、试验方法与结果

1、制备接种菌液:挑选琼脂平板上形态相同的菌落移种于M-H液体培养基中,置35°C温箱孵育4h,校正浊度,或用接接种环挑取菌落,置浮于生理盐水中振荡混匀后与标准化浊管比浊,调整浊度与比浊管相同。

2、接种平板:用无菌棉签蘸取已制备好的接种菌液,在管壁上旋转挤压,去掉过多的菌液,涂布整个M-H培养基表面,并保证涂布均匀。

3、贴纸片:待平板上的水分被琼脂完全吸收后(约15分钟),用无菌镊子取纸片贴在琼脂平板表面,并用镊尖轻压一下,使其贴平。每张纸片间距不少于24mm,纸片中心距平皿边缘不少于15mm。

4、孵育:把贴好药敏纸片的平皿放进35°C温箱培养,最好单独摆放,不超过2个叠在一起,孵育18-24小时后,读取结果。

5、判定结果:培养后取出平板,用游标卡尺测量抑菌环的直径,抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限,然后根据抑菌环直径大小、NCCLS判断细菌的敏感性,并加以记录。

参考文献:

[1] 王辉, 徐英春, 陈民钧. 简要介绍美国NCCLS药敏试验绝版扩散法法规(1993年12月版). 中华医学检验杂志, 1995,18(1):60-62.

[2] 谭瑶, 赵清. K-B纸片扩散法药敏试验. 检验医学与临床, 2010,7(20):2290-2291.

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