镀银法染色细菌鞭毛及注意事项

摘 要:

鞭毛是细菌的运动器官,具有很强的抗原性,即H抗原,对细菌的鉴定、分型及分类具有重要意义。细菌鞭毛染色一直是细菌鉴定的难点之一,主要原因是细菌的鞭毛极细,低于光学显微镜的分辨率,难以直接染色观察。如果要用普通光学显微镜观察细菌鞭毛,必须采用特殊的鞭毛染色法。镀银法染色就是一种常用的细菌鞭毛染色法。

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鞭毛(flagellum)是在某些菌体上附着的细长并呈波状弯曲的丝状物,少则1-2根,多则可达数百根。鞭毛细菌的运动器官。鞭毛抗原具有很强的抗原性,通常称为H抗原,对细菌的鉴定、分型及分类具有重要意义。

细菌鞭毛染色技术一直是细菌鉴定的难点之一,主要原因是细菌的鞭毛极细,直径一般为10-20nm,低于光学显微镜的分辨率,难以直接染色观察,只有用电子显微镜才能观察到。而且细菌的鞭毛与培养条件,如温度、培养基成分和生长阶段等因素有关。

如果要用普通光学显微镜观察细菌鞭毛,必须采用特殊的鞭毛染色法。鞭毛染色方法很多,但其原理基本相同,即在染色前先用媒染剂处理,让其沉积在鞭毛上,使鞭毛直径加粗,然后再进行染色。

镀银法染色就是一种常用的细菌鞭毛染色法。1958年Rhodes根据Fontana的螺旋体改良镀银染色法,建立了一种细菌鞭毛镀银染色法。

1、实验器材

载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、玻片搁架、镊子、接种环,显微镜。

2、染色液

媒染液(A液):10%单宁酸10 ml加5 ml饱和硫酸钾铝水溶液,再加1 ml苯胺饱和水溶液形成沉淀,通过摇动又能重新溶解,加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液,稳定10 min后使用。

银染液(B液):配制5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml备用,再缓慢加入浓氨水(比重0.880)使形成的沉淀刚好重新溶解,最后把备用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入,直到摇动后呈现轻微而稳定的薄雾状溶液为止,避光保存,可稳定数周。

3、载玻片的处理

载玻片应选择光滑无裂痕的玻片,最好选用新的。为了避免玻片相互重叠,应将玻片插在专用架上,然后将玻片置洗衣粉过滤液中(洗衣粉煮沸后用滤纸过滤,以除去粗颗粒),煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干,再放入浓洗液中浸泡5-6天,使用前取出玻片,用自来水冲去残酸,再用蒸馏水洗。将水沥干后,放入95%乙醇中脱水。

4、菌液的准备

菌龄较老的细菌容易失落鞭毛,所以在染色前应将待染细菌在新配制的培养基中连续传代培养3-5代,以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱中培养12-16h。

5、细菌涂片的制备

用接种环挑取菌液数环,移至盛有1-2mL无菌水的试管中,使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37°C恒温箱中静置10min(放置时间不宜太长,否则鞭毛会脱落),让幼龄菌的鞭毛松展开。然后,吸取少量菌液滴在洁净载玻片的一端,将玻片倾斜,使菌液缓慢地流向另一端,用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。

用于鞭毛染色的细菌也可用半固体培养基培养。方法是将0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中,待凝固后在平板中央点接活化了3-4代的细菌,恒温培养12-16h后,取扩散菌落的边缘制作涂片。

6、染色

① 滴加A液,染4-6min。

② 用蒸馏水充分洗净A液。

③ 用B液冲去残液,再加B液于玻片上,在酒精灯火焰上加热至冒气,约维持0.5-1min(加热时应随时补充蒸发掉的染料,不可使玻片出现干涸区)。

④ 用蒸馏水洗,自然干燥。

7、显微镜镜检

先低倍,再高倍,最后用油镜检查。

结果:菌体呈深褐色,鞭毛呈浅褐色。

镀银法染色细菌鞭毛及注意事项

8、注意事项

(1)镀银法染色比较容易掌握,但染色液必须每次现配现用,A染液和B染液最好都现用现配,A液一般不能放置。

(2)细菌鞭毛极细,很易脱落,在整个操作过程中,必须仔细小心,以防鞭毛脱落。

(3)染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。

(4)培养时间要严格掌握,一般培养9-12h较好,菌龄超过15h,鞭毛染色效果较差,这可能与老龄菌体活动度降低、鞭毛易脱落有关。冰箱长期保存的菌种不宜直接用于鞭毛染色,需用新制备的斜面连续转接2-3次后再染色

(5)取菌要取菌落边缘的幼龄菌体。取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下即可,不要用力太猛,更不能用接种环大幅度涂开;将载片稍倾斜,使菌液散开即可,否则鞭毛易脱落,造成染色失败。

(6)固定时只能自然干燥,不能用热风吹干,不能热固定,这是由于加热后菌体易变形,鞭毛易脱落,影响观察。

(7)A染液染3-5min,其后用蒸馏水(自来水效果差)冲洗时一定要充分,否则加B染液后,背景很脏,鞭毛不易被观察到,影响实验效果。

(8)加B染液后,将玻片稍加热(但不能太热,更不能沸腾或蒸干)使其微冒蒸汽,30-60s,染色效果较不加热为好。

(9)B染液染完后,用蒸馏水冲洗比用自来水冲洗效果好。

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