支原体的分离培养方法及常用培养基

摘 要:

支原体常用培养基为PPLO,很多公司都有出售。但血清和醋酸跎需要自己添加。在液体培养基中通常要加入酚红做指示剂。支原体虽然能在人工培养基上生长,但是营养要求较高,而且支原体的分离不太容易,需要多盲传几代。液体培养基变黄后,在固体培养基上单克隆,以纯化分离的支原体。

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支原体常用培养基为PPLO,很多公司都有出售。但血清(常用马血清或猪血清)和抗生素(醋酸跎)需要自己添加。

在液体培养基中通常要加入酚红做指示剂的,当培养基由红色变为黄色时,即可判定支原体的生长程度。需要注意的是,支原体的分离可能不太容易,需要多盲传几代。液体培养基变黄后,在固体培养基上单克隆,以纯化分离的支原体。

一、支原体的培养条件

支原体的培养37°C即可。初次分离培养时,在37°C,5-10% CO2条件下效果更好。

二、支原体的鉴定

主要靠菌落染色、生化反应及特异性生长抑制试验等。

(1)Dienes菌落染色

Dienes染色液:

美蓝:2.5g

天青-II:1.5g

麦芽糖:10g

碳酸钠:0.5g

蒸馏水:100ml

染色时,直接吸染色液覆盖菌落,1min后,用生理盐水洗去染色液,低倍镜下可见支原体菌落呈蓝色,而其他菌菌落不着色。

(2)生化反应

根据不同采样部位及对底物的分解或者作为能源,可以鉴别不同支原体。

解脲支原体分解尿素不分解精氨酸,生成NH3使培养基的ph升高,酚红指示剂变红。

人型支原体分解L-精氨酸不分解尿素,生成NH3使PH值升高,酚红指示剂变红。

肺炎支原体分解葡萄糖,使pH降低,酚红指示剂由红变黄。

(3)在含0.002%美蓝的培养基中肺炎支原体能生长且将美蓝还原而退色,其他口腔、唾液或发酵支原体均被抑制生长,此法可鉴定肺炎支原体。

三、常用的支原体培养基配方

(1)基础培养基

Hayflick培养基(PPLO培养基),牛心粉50g,蛋白胨10g,氯化钠5g,加14g琼脂粉为固体培养基。

(2) 肺炎支原体培养基

基础培养基 70ml

牛血清 (灭活) 20ml

25%的酵母浸液 10ml

50%葡萄糖 1-2ml 0.4

酚红 0.5ml

制霉素 0.001g

青霉素 10万IU

pH 7.8

(3)人型支原体培养基

基础培养基 70ml

马血清 20ml 25%的酵母浸液 10ml

30% L-精氨酸 0.33ml

0.4%酚红 0.5ml

制霉素 0.001g

青霉素 10万IU

pH 6.3

(4)解脲支原体培养基

基础培养基 70ml

马血清 20ml

25%的酵母浸液 10ml

30%尿素0.33ml

0.4%酚红 0.5ml

制霉素 0.001g

青霉素 10万IU

pH 6.0

注:支原体能在人工培养基上生长,但是营养要求较高,需要提供胆固醇和酵母才能生长。以上配方中,马(牛)血清提供胆固醇,酵母浸液提供酵母。

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