细菌内毒素(Endotoxin)的性质和提取方法

摘 要:

内毒素(Endotoxin)即革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖(LPS),存在于细菌的细胞外膜。当细菌细胞外膜结构完整时不具备生物活性,只有当细菌死亡,细胞膜破裂释放出来才表现出内毒素活性。内毒素具有热稳定性,热酚水法是应用最广泛的内毒素提取方法,其它还包括三氯醋酸法、苯酚-氯仿-石油醚法(PCP)、水丁醇法等。

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内毒素(Endotoxin)即革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖(LPS),存在于细菌细胞外膜。当细菌细胞外膜结构完整时不具备生物活性,只有当细菌死亡,细胞膜破裂释放出来才表现出内毒素活性。细菌内毒素生物学活性多样,参与机体许多病理生理反应过程。内毒素可以诱发机体炎症因子的过度释放,导致系统性炎症反应综合症、多器官衰竭,致死率很高,占死因的50-70%。

1、内毒素结构

内毒素(脂多糖)由核心多糖、侧翼多糖及类脂A组成,体积微小,其粒径约1-5毫微米(千分之一微米,1×10-3μm),一般认为其分子量在1000以上。具有水溶性、无挥发性、不带有正电性和负电性等特征。

2、内毒素的热稳定性

细菌内毒素具有耐热性,一般在60°C加热1小时无影响,100°C不裂解,120°C加热4小时能破坏98%,180-200°C干热2小时或250°C加热半小时才能完全破坏。

3、内毒素的提取方法

(1)热酚水法

热酚水法是由Westphal等于1952年建立的细菌内毒素制备方法,后来对方法方法进行了改进[1],是目前应用最广泛的提取内毒素方法。主要用于光滑型(Smooth-type,S型)细菌内毒素的提取,亦可用于粗糙型(Rough-type,R型)细菌内毒素的提取,但产量较低。用这一方法提取的内毒素纯度较高,污染蛋白含量仅为1-3%。

(2)三氯醋酸法

三氯醋酸法提取的内毒素,产量较高,具有良好的抗原性。对O-特异性侧链抗体有血清学特异反应,可结合补体和致敏红细胞,分子量达几百万,但蛋白含量很高,帮纯度较差,目前这种方法已较少使用。

(3)苯酚-氯仿-石油醚法(PCP)

苯酚-氯仿-石油醚法(PCP)对于制备R型细菌的内毒素不仅产量较高,且无核酸污染,污染蛋白含量仅为0.1-1%。

(4)水丁醇法

水丁醇法提取内毒素的效果与酚水法相似,但水丁醇法中残余的酶较多,提取的内毒素,长期储存后,类脂A会被降解。

(5)加热冻存法粗制内毒素

通过反复加热冻存的方法也可从大肠杆菌中提取粗制内毒素。具体方法:将大肠杆菌在2个大气压下,蒸汽高压30min,后-20°C冻存24小时,如此反复高压冻存3次,即可。

参考文献:

[1] Galanos C, Lüderitz O, Westphal O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. Eur J Biochem. 1969 Jun;9(2):245-9.

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