CRISPR及其在原核生物适应性免疫防御系统中的作用

摘 要:

近来在众多原核生物的基因组中发现成簇的、有规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)结构家族。CRISPR由DNA重复单元所构成,在功能上与DNA的重组、修复及原核生物的免疫防御系统关系密切。CRISPR及其相关系统(CASs)基因在原核生物抵抗入侵的噬菌体和质粒的防御系统中发挥着重要作用。

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成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是一类独特的DNA直接重复序列家族,广泛存在于众多原核生物基因组(大多数的细菌和几乎所有的古细菌)。自2002年首次被人们所定义以来,CRISPR一直以其奇特的结构与特殊的功能吸引着各国科学家们的共同关注。它的结构非常稳定,由重复序列(repeats)和被间隔序列(spacers)组成。人们曾对CRISPR系统的功能有过种种推测,最近人们发现Cas系统(CRISPR-associated sequences system,CASs)在原核生物中表现出获得性免疫功能,帮助细菌抵御病毒的侵犯,并和DNA的重组与修复有关。2005年,研究人员发现一些CRISPR的间隔序列是来自噬菌体或质粒等染色体外的序列,据此推断CRISPR系统能使宿主获得抵抗噬菌体、质粒等外来DNA入侵的免疫能力。2007年,Barrangou等通过实验证实了CRISPR系统的这一生物学功能。

一、CRISPR系统的基本结构

随着细菌基因组学的发展,CRISPR的基本结构已逐渐被确定,由短的高度保守的repeat与长度相似的非重复的spacers序列间隔排列所组成的R-S重复单位结构。Repeats是一组高度保守的短小序列,其长度一般为25-50个碱基对。Spacers与repeats的长度相近,约为26-72个碱基对。此外一组约由4-10个保守基因组成的序列被发现于CRISPR周围,称之为CRISPR相关序列(CRISPR-associated sequences,Cas)。在Cas蛋白中已鉴定出核酸内切酶、核酸外切酶、螺旋酶、RNA-和DNA-结合等结构域,因此,认为Cas蛋白参与CRISPR的转录、加工和外来基因序列的降解等过程。

CRISPR及其在原核生物适应性免疫防御系统中的作用

二、CRISPR系统的广泛分布和多样性

在已测序的约40%细菌和90%古细菌基因组中至少存在1个CRISPR座位(locus)。每个CRISPR具有几个到几百个R-S重复单位,平均为66个。Cas基因多达45个家族,根据Cas蛋白的序列同源性、组成情况和功能,可将CRISPR系统分为8个亚型:Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube,各亚型通常具有2-6个亚型特异的cas基因,在没有CRISPR系统的基因组中则不存在相关基因。cas1-cas6这6个家族广泛存在于不同的CRISPR亚型,被认为是核心cas基因,其中只有cas1和cas2家族存在于所有的CRISPR亚型,因此,cas1和cas2家族基因也被用作鉴定CRISPR系统的分子标记。

此外,间隔序列(S)也具有极其丰富的多样性,Horvath等在嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的124个菌株中发现了3626个间区序列,分布在3个CRISPR座位,其中,77%、16%和7%的S序列分别与噬菌体、质粒和嗜热链球菌基因组序列具有同源性。在Bacillus thuringiensis菌YBT-1520和CT-43菌株的染色体上均没有鉴定出CRISPR系统,而在YBT-1520菌株的大质粒pBMB293和CT-43菌株的大质粒pCT283上各存在2个CRISPR座位。pBMB293的CRISPR-1座位包含10个间区序列,其中的5个分别与已知噬菌体GIL16c和Bam35c、质粒pGIL01和pAH187、Halothermothrix orenii H168的染色体有很高的序列同源性;CRISPR-2座位包含5个间区序列,只有1个与已知的质粒序列(pAH187)具有同源性。

三、CRISPR作用机理

1、新间隔序列的获得

在噬菌体等入侵宿主菌后,CRISPR系统会从外来序列中选取一段序列作为新的间隔序列,加工成新的R-S序列后以非同源重组的方式增加到CRISPR簇内,从而使宿主获得抵抗相应噬菌体等再次入侵的免疫能力。新的R-S序列几乎总插入到前导序列和原来的第一个R区之间,因此,前导序列中可能存在相关蛋白(可能是Cas蛋白)的识别位点,在增加新R-S序列过程中起定位的功能。CRISPR系统从噬菌体等基因组中选取新的间隔序列并不是随机的。事实上,在噬菌体、质粒中发现了一些称为前间区序列 (protospacer)的序列,并且在其附近鉴定出一些小的前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motifs,PAMs)。不同CRISPR亚型识别的PAM基序具有亚型特异性。目前,有哪些蛋白质参与PAM基序的识别、前间区序列的选取、间区序列长度如何确定等方面的具体机制尚不清楚。

2CRISPR的转录与加工

CRISPR簇首先转录为长的转录体,即前crRNA,然后逐步被加工成小的crRNA。多数情况下,只有CRISPR簇的编码链被转录和加工。但在古细菌Sulfolobus属和嗜热链球菌,CRISPR簇的2条链都可以被转录。在大肠杆菌K12菌株中,CRISPR簇的前crRNA与Cas蛋白CasABCDE形成的Cascade复合物结合。CasE的功能是将前crRNA切割加工成crRNA。成熟的crRNA分子一般包含5'-端为8-9nt的R区、S区和3'端稍长且更多样化的R区。

CRISPR簇及cas基因的转录受到宿主内多种因素的调控。在大肠杆菌中,组蛋白样拟核结构蛋白(histone-like nucleoid structuring protein,H-NS)能降低CRISPR系统抵抗噬菌体的能力,而转录因子LeuO能解除H-NS的抑制作用。H-NS能与CRISPR簇及cas基因的启动子区结合,抑制CRISPR簇及cas基因的转录。

3CRISPR系统介导的沉默

嗜热链球菌在受噬菌体侵染后,CRISPR簇新获得的间区序列有的来自噬菌体DNA的编码链,有的来自模板链;无论用λ噬菌体的编码链还是用模板链作为人工设计的间区序列,都能有效地使大肠杆菌获得抗λ噬菌体的能力;表皮葡萄球菌的1个CRISPR间区序列与结合转移质粒的切口酶(nickase)具有同源性,而切口酶只在结合转移的供体菌中发挥功能,但CRISPR系统能使供体菌和受体菌都失去结合转移能力。crRNA的作用机理不同于反义RNA,应该是直接作用于DNA。同时,前间区序列邻近基序PAM不仅是选取新间区序列的识别位点,也是crRNA作用于外来DNA的靶标之一。强烈炽热球菌的Cascade复合物包括多个Cmr型的CAS蛋白,由Cas6加工成的前导RNA与该复合物结合后继续被加工,即得到成熟的psiRNA(prokaryotic silencing RNA)。Hale等进行的体外实验表明,单链的psiRNA-Cmr复合物能位点特异地切割RNA而不能作用于DNA,而且切割位点总位于psiRNA的3'-末端往前14nt。这种作用机理与真核生物的siRNA极其相似,只是还没有psiRNA作用于天然靶标(来自噬菌体、质粒的转录体)的体内证据。因此,前crRNA加工为成熟的crRNA后,是直接作用于DNA还是RNA,至今仍处于争论期,或许二者兼而有之,但谁主谁次尚不清楚。

4、自我与非我的区分

一般情况下,免疫系统能很好地区分自我与非我,从而快速产生针对外来成分的免疫反应,同时避免产生自身免疫。Marraffini等通过向敲除了CRISPR簇的表皮葡萄球菌菌株中回补不同的CRISPR簇的突变体,并转入带有前间区序列及其邻近基序PAM(进行了个别重要碱基的替换)的外来DNA序列,他们发现成熟crRNA的5'-端重复序列(R区)在保护自身CRISPR簇不被切割时起主要作用,也暗示成熟crRNA5'-端的均质性(5'-端R区为8-9nt,3'-端R区更长且多变)对crRNA发挥功能的重要性;同时,外来DNA中的前间区序列邻近基序PAM在区分自我与非我的过程中也起关键作用。值得关注的是,Stern等最近发现了自靶向的间区序列(self-targeting spacers)。他们分析了来自330种含CRISPR系统的原核生物的23550个间区序列(S区),发现每250个间区序列中就有1个是自靶向的,所研究的330种原核生物中有18%存在自靶向的间区序列。由于缺乏保守性,而且在自靶向间区序列的附近存在大量已退化的重复序列,因此,他们认为存在自靶向的间区序列不是其他调控机制而是一种自身免疫机制。

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