CRISPR/Cas系统的结构及基因组定点修饰的作用机制

摘 要:

CRISPR/Cas是基于细菌获得性免疫系统改造而成,其特点是制作简单、成本低、作用高效。CRISPR/Cas结构相对简单,其作用机理可以分为三个阶段,第一是CRISPR的高度可变的间隔区的获得,第二是CRIPSR基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工),第三是CRISPR/Cas系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰。

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基因定点修饰是研究基因功能的重要手段之一,也可被用于人类遗传性疾病的治疗,因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点。早期仅基于同源重组的基因打靶技术效率极低,应用受到限制。直到人工核酸内切酶(engineered endonuclease,EEN)出现,将这一现状彻底改变。

2013年初,一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9出现。CRISPR-Cas是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术,它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成,其特点是制作简单、成本低、作用高效。

一、CRISPR/Cas基因座结构

CRISPR/Cas的基因座结构相对简单。以产脓链球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的典型TypeⅡ CRISPR/Cas为例,其基因座结构可分别三部分:5'端为tracrRNA基因,中间为一系列Cas蛋白编码基因,包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2,3'端为CRISPR基因座,由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(direct repeats)顺序排列组成。

CRISPR/Cas系统的结构及基因组定点修饰的作用机制

CRISPR是一种特殊的DNA重复序列家族,广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点(基因座)通常由短的高度保守的重复序列(repeat)组成,重复序列的长度通常为21-48bp,重复序列之间被26-72bp间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列与靶基因进行识别。

Cas(CRISPR associated)家族存在于CRISPR位点附近,是一种双链DNA核酸酶,能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与fold酶功能类似,但是它并不需要形成二聚体就能发挥作用。

CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统,通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别,利用Cas蛋白进行切割,从而发挥免疫防御的功能。

二、CRISPR/Cas作用机制

CRISPR/Cas的作用机理可以分为三个阶段,第一是CRISPR的高度可变的间隔区的获得,第二是CRIPSR基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工),第三是CRISPR/Cas系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰。

CRISPR/Cas系统的结构及基因组定点修饰的作用机制

CRISPR的高度可变的间隔区(spacer)获得,其实就是指外来入侵的噬菌体或是质粒DNA的一小段DNA序列被整合到宿主菌的基因组,整合的位置位于CRRSPR的5'端的两个重复序列之间(repeats)。因此,CRISPR基因座中的间隔序列从5'到3'的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列被称为protospacer,通常protospacer的5'或是3'端延伸几个碱基序列很保守, 被称为PAM (protospacer adjacent motifs),它的长度一般为2-5碱基,一般与protospacer相隔1-4 碱基。新间隔序列的获得可能分为三步:首先识别入侵的核酸和扫描外源DNA潜在的PAM,将临近PAM的序列作为候选protospacer;然后在CRISPR基因座的5'端合成重复序列;最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间。目前只有第一个步骤被证实,Cas1和Cas2蛋白是负责新间隔序列获得的核心蛋白。另外研究发现TypeⅡ型CRISRP/ Cas系统中Csn2蛋白对于新的间隔序列的获得也是必需的。

CRISPR基因座首先被转录成前体CRISPR RNA (pre-crRNA),然后在Cas蛋白或是核酸内切酶的作用下被剪切成一些小的RNA单元,这些小RNA即为成熟crRNA,由一个间隔序列和部分重复序列组成。TypeⅡ型CRISPR/Cas系统crRNA的成熟除了需要Cas9和RNaseⅢ参与以外,还需要tracrRNA的指导。CRISPR基因座在没有受到外界压力的情况下表达水平很低。当外源的质粒或是噬菌体入侵宿主菌时CRISPR的表达很快被诱导上调。

干扰是CRISPR/Cas发挥抵御外源遗传物质入侵最关键的步骤,成熟的crRNA与特异的Cas蛋白形成核糖核蛋白复合物,再与外源DNA结合并扫描到外源DNA,寻找其上的靶序列,crRNA的间隔序列与靶序列互补配对,外源DNA在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割。早期研究认为crRNA的间隔序列(spacer)与外源DNA的靶位点完全互补配对对于切割是必需的,但是后来的研究证明spacer与protospacer部分互补配对时切割也可以发生。

参考文献:

方锐, 畅飞, 孙照霖, 等. CRISPR/Cas9 介导的基因组定点编辑技术. 生物化学与生物物理进展, 2013, 40(8): 691-702.

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