规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)系统的结构与免疫防御功能

摘 要:

规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR系统的主体是由同向重复序列与间隔序列构成的多段R-S结构组成。CRISPR系统针对噬菌体入侵、质粒接合和转化所造成的基因导入而形成特异性的免疫防御机制,即CRISPR干扰。CRISPR干扰的免疫过程主要包括3个阶段:适应、表达和干扰。

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在自然界中,细菌一直受到外界各种因素的干扰,如噬菌体作为细菌的天敌,数量远远超过了细菌的数量,对于细菌的生存造成了极大威胁。此外,自然界中的各种遗传元件 (如质粒、整合子等) 也可以通过噬菌体转导、质粒结合和转化等水平基因转移的方式进入到细菌细胞中,这不仅会破坏细菌遗传物质的稳定性,而且毒力或耐药基因的转移与整合还可能会造成新型致病菌的出现。CRISPR作为细菌一种特异性的防御机制,能够有效防御质粒或噬菌体对于细菌本身的水平基因转移,保持自身遗传信息的完整性。

一、CRISPR的发现历史

1987年,日本大阪大学(Osaka Unisity)在对大肠杆菌K12编码的碱性磷酸酶基因进行研究时,发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段,这些片段是由串联间隔重复序列组成,而且在片段的两端还存在一段不太长的特有序列。随后的研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌基因组中。2002年,科学家将其正式命名为规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)。

二、CRISPR系统的基本结构

CRISPR是一种特殊的DNA重复序列家族,广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点(基因座)通常由短的高度保守的重复序列(repeat)组成,重复序列的长度通常为21-48bp,重复序列之间被26-72bp间隔序列(spacer)隔开。CRISPR基因结构的主体就是由同向重复序列( repeat) 与间隔序列 ( spacer) 构成的多段R-S结构组成,称为CRISPR基因座( CRISPR locus),在R-S结构之前,是前导序列( leader)与一系列的CRISPR相关蛋白基因座( CRISPR-associated /CAS genes)。Cas蛋白基因、前导序列、CRISPR基因座共同构成了CRISPR系统。

规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)系统的结构与免疫防御功能

三、CRISPR系统的免疫防御功能

2005年,一些研究小组发现CRISPR系统的间隔序列与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源,推测其功能可能与细菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关。2006年,美国研究小组通过生物信息分析预测,CRISPR系统可能以类似于真核生物的RNAi方式发挥其免疫功能。2007年,Barrangou等首次发现并证明细菌可能利用CRSPR系统对抵抗噬菌体入侵。2008年,Marraffini等发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移,首次利用实验验证了CRISPR系统的功能,由此科学家们揭开了研究CRISPR系统作用机制的序幕。

CRISPR系统针对噬菌体感染、质粒接合和转化所造成的基因导入而形成特异性的防御机制,被称为CRISPR干扰。CRISPR干扰的免疫过程主要包括3个阶段:适应、表达和干扰。

(1)适应阶段。CRISPR系统会将一段与质粒或噬菌体上基因片段(原间隔序列proto-spacers) 同源的短片段DNA插入到前导序列与第一段重复序列之间,每一次插入活动都伴随着重复序列的复制,进而形成一个新的R-S单元,这样使得CRISPR基因座中存在着此种质粒或噬菌体的序列信息,为适应性免疫奠定了结构基础。

(2)表达阶段。CRISPR基因座会被转录成一段长链的CRISPR RNA ( crRNA) 前体( pre-crRNA),这一前体将会在重复序列处被剪切,而后被Cas内切酶加工成小crRNA。成熟的crRNA会与Cas蛋白结合形成Cas/crRNA复合体,在干扰阶段发挥作用。

(3)干扰阶段。crRNA作为Cas/crRNA作用复合体的向导,协助其寻找与其同源的外源核酸靶标,当crRNA与前间区序列互补配对完成时,作用复合体会将靶标降解。

在CRISPR免疫的3个阶段中,适应阶段又可称为信息处理阶段,此阶段的作用机制在不同的CRISPR系统中是高度保守的,主要作用蛋白为Cas1和Cas2蛋白;而表达和干扰两个阶段又可被称为执行阶段,此阶段的作用机制在不同的CRISPR系统中有较大的差异,作用蛋白也有所差别。

CRISPR干扰与RNA干扰( RNAi)极其相似,但是二者在蛋白结构、防御机制、作用靶标等方面也存在较多的不同,而且真核生物会利用RNAi相关通路调节胞内基因表达,而根据目前的报道,CRISPR的功能仅限于防御外源基因。

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