动物布鲁氏菌病检测方法——试管凝集试验

摘 要:

1897年Wright等人发现布鲁氏菌病人血清与马尔他布鲁氏菌的培养物可以产生凝集现象,从而建立了试管凝集试验(SAT)。由于SAT是一种特异、稳定、较敏感的检测方法,因此布鲁氏菌病试管凝集试验一直是各国用作诊断人和动物布鲁氏菌病的常规血清学诊断方法,我国亦将其列为动物布鲁氏菌病诊断的法定正式试验。

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1897年,Wright等人发现布鲁氏菌病人血清与马尔他布鲁氏菌的培养物可以产生凝集现象,遂称之为莱特氏(Wright)凝集反应,从而建立了试管凝集试验(SAT)。由于SAT是一种特异、稳定、较敏感的检测方法,因此布鲁氏菌病试管凝集试验一直是各国用作诊断人和动物布鲁氏菌病的常规血清学诊断方法,我国亦将其列为动物布鲁氏菌病诊断的法定正式试验。布鲁氏菌病试管凝集试验方法如下:

本方法摘自于中华人民共和国国家标准GB/T18646-2002。

一、材料准备

1、稀释液:0.5%石炭酸生理盐水。

配制方法:称取0.5g石炭酸,加入100ml生理盐水中,121°C高压灭菌30min。

检验羊血清时用含0.5%石炭酸的10%盐溶液,如果血清稀释用含0.5%石炭酸的10%盐溶液,抗原的稀释应用含0.5%石炭酸的10%盐溶液。

2、抗原、阳性血清和阴性血清由制标单位提供,按说明书使用。

3、凝集试验管(三分管)、试管架、吸管及温箱。

二、操作方法

1、按常规方法采血分离血清。

2、运送和保存血清样品时防止冻结和受热,以免影响凝集价。若3d内不能送到实验室,按每9mL血清加1ml 5%石炭酸生理盐水(徐徐加入)防腐,也可用冷藏方法运送血清。

3、受检血清的稀释

以羊和猪为例,每份血清用4支凝集试管。

3.1 第1管标记检验编码后加1.15mL稀释液。

3.2 第2-4管各加入0.5mL稀释液。

3.3 然后用1ml吸管取被检血清0.1mL;加入第1管内,并混合均匀。混合方法是将该试管中的混合液吸人吸管内,再沿试管壁吹入试管中,如此吸入、吹出3-4次,充分混匀后以该吸管吸混合液0.25ml弃去,

3.4 取0.5mL混合液加入第2管,用该吸管如前述方法混合。

3.5 再吸第2管混合液0.5mL至第3管,如此倍比稀释至第4管,从第4管弃去混匀液0.5mL。

3.6 稀释完毕,从第1至第4管的血清稀释度分别为1:125、1:25、1:50和1:100。

3.7 牛、马、鹿、骆驼血清稀释法与上述基本一致,差异是第一管加1.2mL稀释液和0.05mL被检血清。

3.8 将0.5mL20倍稀释的抗原加入已稀释好的各血清管中,并振摇均匀,羊和猪的血清稀释则依次变为1:25、1:50、1:100和1:200,牛、马和骆驼的血清稀释度则依次变为1:50、1:100、1:200和1:400。

大规模检疫时也可只用2个稀释度,即牛、马、鹿、骆驼用1:50和1:100,猪、山羊、绵羊和狗用1:25和1:50。

3.9  置37-40°C温箱24h,取出检查并记录结果。

3.10 每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照,即

a) 阴性血清对照:阴性血清的稀释和加抗原的方法与受检血清同。

b) 阳性血清对照:阳性血清须稀释到原有滴度,加抗原的方法与受检血清同。

c) 抗原对照:1:20稀释抗原液5mL,再加0.5mL稀释液,观察抗原是否有自凝现象。

三、结果判定

1、凝集反应程度分为:

每次试验须配制比浊管作为判定的标准依据,参照比浊管,按各试管上层液体清亮度判读

a) ++++菌体完全凝集,100%下沉,上层液体100%清亮;

b) +++菌体几乎完全凝集,上层液体75%清亮;

c) ++菌体凝集显著,液体50%清亮;

d) +凝集物有沉淀,液体25%清亮;

e) -凝集物无沉淀,液体均匀混浊。

2、牛、马、鹿和骆驼1:100血清稀释,猪、山羊、绵羊和狗1:50血清稀释,出现“++”以上凝集现象时,受检血清判定为阳性。

3、牛、马、鹿、骆驼1:50血清稀释,猪、山羊、绵羊、狗1:25血清稀释,出现“++”以上凝集现象时,受检血清判定为可疑反应。

可疑反应家畜经3-4周后重检,如果仍为可疑,该牛、羊判为阳性。猪和马经重检仍保持可疑水平,而农场的牲畜没有临床症状和大批阳性患畜出现,该畜被判为阴性。

猪血清偶有非特异性反应,须结合流行病学调查判定,必要时应配合补体结合试验和鉴别诊断,排除耶森氏菌交叉凝集反应。

四、影响试验结果的因素及注意事项

1、受检血清应新鲜、无溶血、无污染,存放血清处温度不能超过10℃,采血后应于3-4日内进行检查,因放置时间过长可能会导致血清效价降低。

2、 遵守操作规程:所用的器材要清洁、干燥,试剂的加量一定要正确,放入温箱的温度和时间都要按要求,否则都影响结果。每份血清和抗原均要有对照。

3、高渗盐水作凝集反应,一般浓度在10~12%,一般切记人血清不能用高渗盐水。

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