耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)及其检测方法

摘 要:

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是常见的“超级细菌”之一,也是主要的食源性病原菌。MRSA耐药的主要原因是其携带的mecA基因编码的青霉素结合蛋白PBP2a。常规的MRSA检测方法包括苯唑西林纸片扩散法、乳胶凝集试验和苯唑西林琼脂筛选方法,以及PCR和环介导等温扩增(LAMP)等分子生物学诊断方法。

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金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)是主要的食源性微生物,由其引起的食品中毒事件在革兰氏阳性菌中高居首位。据统计,在美国,由金葡菌引起的食物中毒占33%,仅次于大肠杆菌。在加拿大,金葡菌占细菌性食物中毒的45%。在某些欧洲国家,如匈牙利、芬兰等则占50%以上。在日本,1980-1999年间共超过2500起葡萄球菌中毒报道,受感染人数约6万人。在我国,每年由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也屡见不鲜。

金黄色葡萄球菌是典型的耐药微生物,是潜在的“超级细菌”。1961年Jevons在英国首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureusMRSA),MRSA在20世纪60年代中期扩展至欧洲及北美等地区,逐渐成为世界范围内的主要病原菌

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)及其检测方法

MRSA从首次发现至今,其耐药程度日益严重。上世纪80年代,庆大霉素是一般治疗MRSA感染的有效药物,而目前MRSA对其耐药率已超过50%。同期,MRSA对曾经的保留用药氟喹诺酮类药物高度敏感,但当前80%以上的MRSA对其耐药。研究发现,MRSA耐药的主要原因是其携带的mecA基因编码的一种对β-内酰胺类抗生素具低亲和力的青霉素结合蛋白PBP2a。PBP2a蛋白分子量为78kD,当金葡菌固有的PBPs被β-内酰胺类抗菌药物结合失活后,PBP2a能替代其发挥转肽酶的功能,促进细胞壁合成,从而产生耐药性 [1]。根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)标准,金葡菌在检出mecA基因或者PBP2a蛋白时即可定义为MRSA,但不同菌株的耐药程度有所差异。

常规的MRSA检测方法包括:苯唑西林纸片扩散法、乳胶凝集试验和苯唑西林琼脂筛选方法。最近,临床和实验室标准化研究所(CLSI)推荐使用的头孢西丁纸片扩散法检测MRSA [2],以及还有一些其他的检测方法。

1、纸片扩散法检测MRSA

纸片扩散法包括苯唑西林和头孢西丁纸片扩散法,其步骤一般包括制备菌液、接种平板、贴药敏纸片、培养等。前者把菌株在1μg苯唑西林MH琼脂培养基进行试验,抑菌圈在35°C培养24小时确定;其抑菌圈大小是根据CLSI(2008)的标准进行判断:抑菌环直径≤10 mm为耐药,11-12 mm为中介,≥13 mm为敏感;当抑菌圈直径在11~12 mm时判断为中间,需加做mecA或PBP2a的检测以证实是否为MRSA。该方法最大优点是快速、简便、价格便宜,易被检验人员接受。该方法对MRSA检出敏感性、特异性较高,是目前临床微生物实验室常规筛检MRSA方法之一。但其特异性低于其他方法。

2、苯唑西林琼脂筛选

MH培养基加NaCl (40 g/L)和苯唑西林(6 μg/ml),将菌液(0.5麦氏浊度)画线在培养皿上35°C培养24 h,只要平皿有菌生长,即使是一个菌落也判断为MRSA,敏感度为100%。与常规方法相比,该方法在MRSA检测上并无显著性,但对于其它葡萄球菌,琼脂筛选法有较高的阳性率,因此尤其适用于多种葡萄球菌中MRSA的检测。该法操作简便、成本低,一个平板可同时检测多个样品,检出率高,较为实用,可用于MRSA的常规检测;尤其当多种检测方法结果不一致时,应以琼脂筛选为准。

3、乳胶凝集试验

凝集试验是一种快速、操作简便的免疫学诊断方法,在临床快速诊断MRSA方面应用广泛。其原理是抗PBP2a单克隆抗体致敏的乳胶颗粒与MRSA的膜蛋白提取物作用,如产生肉眼可见的凝集颗粒证实有PBP2a存在,判断其为MRSA。该方法的敏感性≥97%,同时,该方法与mecA基因检测相关性好、快速简便、特异性强、灵敏度高,不需特殊仪器和技术,尤其适合用于MRSA早期检测,可作为PCR法的替代方法;但检测成本较高。

4、分子生物学诊断方法

自上世纪90年代起,分子生物学方法在微生物检测中逐渐取代传统方法,主要包括PCR、荧光定量PCR与各种新型核酸扩增技术环介导等温扩增(LAMP)技术等。其中LAMP 法由于具有简便、快速、特异性强和灵敏度高等优势,已获得越来越多的关注,显示出较好的实际应用价值。

参考文献:

[1] Labischinski H. Consequences of the interaction of beta-lactam antibiotics with penicillin binding proteins from sensitive and resist ant St aphylococcus aureus strains. Medical microbiology and immunology, 1992,1815.

[2] Steinkraus G, White R, Friedrich L.Vancomycin MIC creep in non-vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (VISA), vancomycin-susceptible clinical methicillin-res istant S. aureus (MRSA) blood isolat es from 2001 –05. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2007, 60(4): 788-794.

    日期:2015年02月07日  分类:病原菌
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