试管凝集试验检测抗原的实验方法

摘 要:

颗粒性抗原与相应抗体相遇,在有适量电解质存在时,可以形成肉眼可见的凝集团块。试管法凝集试验根据颗粒抗原凝集的程度,可以判断待检血清中有无相应抗体及其效价,是一种半定量试验。结果观察前切勿摇动试管,以免凝集块分散,在暗背景下透过强光检查,通常将出现明显凝集(++)现象的最高血清稀释倍数作为该血清凝集效价。

关键词:

颗粒性抗原与相应抗体相遇,在有适量电解质存在时,形成肉眼可见的凝集团块现象,即称之为凝集反应。试管法凝集试验是用定量抗原悬液与一系列倍比稀释的待检血清混合,置37°C静止反应。根据每管内颗粒抗原凝集的程度,以判断待检血清中有无相应抗体及其效价。是一种半定量试验。下面以出血性大肠杆菌O157:H7为例,介绍试管凝集试验的详细实验方法。

试管凝集试验检测抗原的实验方法

一、主要试剂

1、诊断菌液:出血性大肠杆菌O157:H7培养菌液离心后,用0.9%生理盐水重悬并调整约到109 CFU/ml。

2、待检血清:待检血清用生理盐水做1:10稀释。

二、主要仪器

小试管,试管架,吸管,恒温水浴箱或温箱等。

三、实验步骤

试管凝集试验检测抗原的实验方法

1、排管并做标记:准备小试管7支,排列于试管架上,标明序号。

2、每管内加入0.5 ml生理盐水。

3、稀释被检血清:

① 吸取1:10待检血清0.5ml加入第一管中,充分混匀,使血清稀释成1:20。

② 吸取上述1:20血清稀释液0.5ml,放入第2管中,充分混匀,使血清稀释成1:40。

③ 吸取上述1:40血清稀释液0.5ml,放入第3管中,充分混匀,使血清稀释成1:80。

④ 如此连续稀释到第7管为止。

⑤ 第7管只加生理盐水0.5ml,不加血清,作为生理盐水对照。

⑥ 稀释后,第1至第7管的血清稀释度依次为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640。

4、加入O157菌液:将稀释后的O157菌液分别加于每一试验管及生理盐水对照管,每管0.5ml。此时第1管至第7管的血清因加入等量菌液而又稀释一倍,血清最后稀释度:1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280。

5、振摇混匀、保温:将所有试管振摇、混匀后,置37°C温箱或水浴反应过夜。

 四、结果观察

1、观察条件:有良好的光源和黑暗的背景。

2、取出试管:从温箱或水浴箱中轻轻取出试管架,不要摇动试管。

3、观察方法:把试管举起以观察试管内的上清液浊度和管底凝集物,然后再轻摇试管,使凝集块从管底升起(注意观察凝集物的松软程度、大小、均匀度等性状)。按液体的清浊、凝块的性状记录结果。

4、观察顺序:应先看盐水对照管(8号管),此管应呈阴性,即不凝集。然后由1号管至7号管依次观察。

五、结果记录

凝集强弱的判定以“+”号表示。

1、(++++)很强:上清液完全透明,细菌全部形成凝块,沉于管底。

2、(+++)强:上清液透明度达75%(微混),大部分细菌形成凝块,沉于管底。

3、(++)中等强:上清液透明度达50%(较混浊),约50%细菌形成凝块。

4、(+)弱:上清液透明度只达25%(混浊),仅有小部分细菌形成凝集。

5、(—)不凝集:液体均匀混浊,无凝集。轻轻摇动试管,细菌分散。

效价结果:出现明显凝集(++)现象的最高血清稀释倍数作为该血清凝集效价。

六、注意事项

1、抗原抗体比例必须适当,才能出现肉眼可见的反应。如果抗体浓度过高,会出现前带现象,要对抗体进一步稀释,需要与阴性加以鉴别。

2、判断结果时,应在暗背景下透过强光逐管检查。

3、将两种液体混合时,应防吸进空气,以防产生气泡或使液面溢出试管。

4、观察结果前切勿摇动试管,以免凝集块分散。

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