基于PCR技术的全基因组扩增技术原理及方法

摘 要:

很多检测技术都是基于DNA建立的方法,但有时难以获得足够的样品进行分析。全基因组扩增技术(Whole genome amplification,WGA)能够实现对基因组的扩增以提供大量可供分析的样品。基于PCR建立的WGA技术主要包括引物延伸预扩增法、简并寡核苷酸引物PCR和连接介导PCR。但无论哪一种方法,都存在非特异性扩增现象,因此对现有方法加以改进WGA方法研究中需要解决的问题。

目前,很多检测技术都是基于DNA建立的方法,但由于各种各样的原因,很多时候难以获得足够的原始样品进行分析。全基因组扩增技术(Whole genome amplification,WGA)能够实现对基因组的扩增以提供大量可供分析的样品。高灵敏度WGA 技术的不断进步极大促进了单细胞全基因组测序技术的发展,其中一种WGA技术就是基于PCR建立的方法,主要包括以下几种。

1、引物延伸预扩增法

在所有WGA方法中,引物延伸预扩增法(Primer extension preamplification,PEP)是较早出现的一种。PEP法是基于PCR技术发展而来的WGA方法,主要原理是使用15个碱基长的随机引物(N15,理论上有415种组合)在37°C的低退火温度下进行较长时间的退火,然后缓慢升温至55°C进行长时间的引物延伸,如此反复多个循环。后来对PEP方法进行了改进,包括对模板DNA的提取方法、反应循环条件的优化以及高保真聚合酶的使用等。但由于PEP法使用随机引物以及不太严格的PCR循环参数,因此可能导致不均衡的扩增结果产生。

2、简并寡核苷酸引物PCR

与PEP法类似,简并寡核苷酸引物PCR法(Degenerate oligonucleotide primed PCR,DOP-PCR)也是一种基于PCR技术的全基因组扩增方法,其原理是使用部分简并引物进行PCR反应(引物中间部分含有6个随机碱基),在最初的几个循环中使用较低的温度(~25°C)进行退火以确保引物与模板的结合,并缓慢升温至引物延伸温度进行引物延伸。完成最初几个循环后,使用相对较高的退火温度(~55°C)进行多循环常规PCR反应。对DOP-PCR结果影响较大的是因素是聚合酶及引物浓度,因此需要进行优化以获得最佳实验结果。DOP-PCR法虽然使用相对PEP法更为严格的PCR反应条件,但引物与模板间结合的不确定性以及引物间的相互作用仍可能导致较低的全扩增灵敏度及较高的错误率,因此,一定程度上限制了该方法的应用。

3、连接介导PCR

广义上连接介导PCR(ligation-mediated PCR,LM-PCR)指的是有接头连接过程参与的PCR反应,相对于PEP与DOP-PCR,连接介导PCR最初并非设计用来进行全基因组扩增。LM-PCR全扩增技术需要通过3个步骤来实现:(1)模板DNA的片段化处理:通过物理剪切或限制性内切酶处理使基因组DNA断裂成若干适合PCR扩增的片段;(2)模板片段与接头连接:根据酶切片段类型设计可与之连接的接头,在DNA连接酶的作用下与模板片段两端连接,接头中含有一段外源通用引物序列,用作下一步PCR反应中的引物;(3)全扩增PCR反应:连接成功的模板片段经引物延伸后两端形成了通用引物结合位点,因此可以外源引入的通用引物进行PCR反应,包括接头在内的模板片段可同时得到扩增。

对基因组的片段化处理是LM-PCR全扩增技术的关键步骤之一,其对接下来的连接反应及PCR反应具有较大影响,使用物理剪切法可较好保证片段长度的均一性,但需要进行片段平末端化处理。

但无论哪一种基于PCR的全基因组扩增方法,都存在一定的非特异性扩增现象,即使在较为严格的PCR反应条件下这一问题仍无法完全避免,因此对现有方法加以改进抑制非特异性扩增也是当前WGA方法研究中需要解决的问题,如数字微滴PCR(Digital microdroplet PCR)的发展可为基于PCR技术的WGA方法带来一些新的思路。

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