细菌生物膜(菌膜)体外培养方法及检测评估方法

摘 要:

细菌生物膜的形成是细菌在材料表面形成菌落,菌落生长包埋于胞外脂多糖基质中。常用的细菌生物膜培养方法主要有微孔板法、试管法、置片法、平板膜片法、管路法、刚果红琼脂培养法、噻唑蓝比色法等。生物膜鉴定分析方法有结晶紫染色定性分析法、超声波活菌计数法、扫描电镜观测生物膜分析法和激光共聚焦显微镜生物膜分析方法。

关键词: ,

细菌生物膜又叫作菌膜,是细菌为了适应生存环境而形成的与浮游细胞相对应的生存形式,属于细菌在特殊环境下的生存状态。细菌生物膜的形成过程是细菌与材料表面接触附着,在材料表面形成菌落,菌落生长包埋于胞外脂多糖基质中。生物膜一旦形成即具有较强的黏附力,很难清除。一般的抗生素和消毒剂很难穿透生物膜的胞外脂多糖基质层,造成杀灭和清洗困难。常用的细菌生物膜培养方法主要有微孔板法、试管法、置片法、平板膜片法、管路法、刚果红琼脂培养法、噻唑蓝比色法等。

一、细菌生物膜体外培养形成方法

1、试管生物膜培养法

绿脓杆菌为例,用接种环从长满细菌的斜面取菌苔接种到带有玻璃珠的生理盐水中,震荡混匀,使含菌量达到106-107 CFU/ml。再将生理盐水菌悬液从原液按20%体积分数为梯度稀释至20%,共5组浓度菌悬液分装到无菌试管内,置于温箱中静置培养。

细菌生物膜(菌膜)体外培养方法及检测评估方法

2、玻片生物膜培养法

将15mm×15mm的盖玻片脱脂处理后,用磷酸盐缓冲液清洗干净,凉干灭菌备用。将处理好的盖玻片放入6孔板中,加入5ml 0.3% TSB培养液,同时接种0.2ml细菌悬液混匀。将6孔板置于28°C温度条件下培养24h,可连续培养1周,培养期间每隔24h更换培养液,也可置于恒温摇床上进行振荡,模拟一定的剪切效果。

3、生物膜反应器培养法

选取特定材质的生物膜培养片(玻片、金属片或塑料片等),超声波清洗干净,用去离子水冲洗,备用。将备好的生物膜培养片安装在反应杆上,旋紧固定螺丝,于主反应器中倒入500ml TSB溶液。装配整套反应容器,用铝薄封闭多余的连接口,于121°C压力蒸汽灭菌器内灭菌20min,冷却备用。将主反应器平放在磁力搅拌器上,无菌接种1ml含菌量为108 CFU/ml绿脓杆菌菌悬液,使反应器内的菌液浓度达到105-106 CFU/ml。打开磁力搅拌器,以125 rmp/min速度常温震荡培养24h。在储液罐中添加20L灭菌TSB溶液,打开蠕动泵,控制流速在11.7ml/min,流动培养24h。在无菌条件下,取下生物膜培养片,放入装有10ml生理盐水试管中,超声震荡10min,进行活菌计数培养。

二、生物膜鉴定分析方法

1、结晶紫染色定性分析法

结晶紫染色分析法是最常用的检测方法,利用生物膜内物质可与某些染料结合的特点,通过染色的方法对生物膜进行定性或定量分析。其具体实验方法可以参考http://www.bacteria.cn/html/2014/935.html。如果结晶紫着色较深,说明生物膜形成比较成熟,如果着色较浅,说明生物膜基本没有形成或牢度不够。

2、超声波活菌计数法

采用超声的方法来进行菌落计数,将生物膜培养片放入带盖子的玻璃瓶中,每个玻璃瓶中放入20ml无菌生理盐水,经一定功率超声一定时间后,取1ml样液进行培养计数。

3、扫描电镜观测生物膜分析法

将生物膜样片经乙醇梯度逐级脱水干燥处理,用导电胶固定在电镜上喷金,在扫描电镜下观测并拍照。

4、激光共聚焦显微镜生物膜分析方法

选取培养好的生物膜样片,在激光共聚焦显微镜下观察到生物膜在不同时间点随清洗液流过的形态。通过激光共聚显微镜可在第一时间直接观察到新鲜、完全水合的生物膜状态,利用特殊软件可作三维图象分析。

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  1. avatar 啦啦啦啦

    没注明出处,想进一步了解没有渠道呢

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