96孔微量板定量检测细菌生物膜的方法步骤(protocol)

摘 要:

96孔微量板定量检测法(polystyrene microtiter plate assay)检测细菌生物膜有着许多优势。一方面,在对大批样品快速操作时能保持试验的一致性。另一方面,微量板定量检测法不仅能对细菌形成生物膜定性,而且还能定量计算细菌形成生物被的能力,因此96孔微量板法被广泛应用于定量检测细菌生物被膜的方法。

关键词: ,

相对于其它细菌生物膜体外培养方法而言,微孔板法有着当然的批处理优势,尤其是在对大批样品快速操作时还能保持试验的一致性,使得96孔板,乃至384孔板检测法大量应用于细菌生物膜的研究。微量板定量检测法(polystyrene microtiter plate assay)不仅能定性细菌能否形成生物膜,而且和不同染色方法结合,还能定量计算细菌形成生物被的能力,这对实验室生物被膜研究工作是非常有利的,因此96孔微量板定量检测法是目前实验室广泛应用的定量检测细菌生物被膜的方法。

主要试剂和仪器:

聚苯乙烯96孔板、PBS缓冲液、甲醇、1%结晶紫溶液、33%冰乙酸溶液、酶标仪或分光光度计。

实验步骤:

(1) 在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μl培养液,接种10μl过夜培养菌液,37°C静置孵育36h;

(2)将培养液吸出,每孔加入200μl无菌PBS缓冲液清洗板孔3次;

(3) 每孔加入100μl甲醇固定15min,然后吸出培养孔中的甲醇,自然风干;

(4) 每孔加入100μl 1%结晶紫溶液,室温下染色5min;

(5) 吸出培养孔中的结晶紫染色液后,用流水把多余的染料冲洗干净;

(6) 把培养板倒置在滤纸上除去残余的水,并在37°C烘箱中烘干或室温凉干;

(7) 完全干燥后,每孔加入100μl 33%冰乙酸溶液,在37°C培养箱中作用30min以溶解结晶紫;

(8) 590nm条件下,用酶标仪测定培养孔中溶液的OD值;

(9) 每次试验每种菌株做3个孔的重复,试验数值取3次平均值(D值);

(10) 以未接种菌的培养液作为阴性对照,阴性值的2倍作为界限值(Dc)。

结果判定:

基于D值,菌株可分为3类:

(1)强生物被膜形成株(D>2×Dc);

(2)弱生物被膜形成株(Dc<D≤2×Dc);

(3)无生物被膜形成株(D≤Dc)。

96孔微量板定量检测细菌生物膜的方法步骤(protocol)

2004年,Fox等采用微量板定量检测法对分离自45个奶牛场的牛奶、奶牛乳头皮肤和挤奶器的221株金黄色葡萄球菌的生物被膜形成情况进行了研究,鉴定出牛奶中分离的葡萄球菌41.4%有生物膜形成,皮肤和机器中分离的葡萄球菌分别为24.7%、14.7%有生物膜形成,表明与牛奶密切相关的金黄色葡萄球菌比乳腺外源葡萄球菌更容易形成生物被膜,并证明生物被膜形成是奶牛乳内感染的一个危险因素。

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目前评论:26   其中:访客  16   博主  8   引用   2

  1. avatar 牛牛小宇

    你好,我是第一次做生物膜实验,我想问您所用的培养液是什么?33%冰乙酸溶液能将结晶紫溶液溶解吗?(7)完全干燥后,每孔加入100μl 33%冰乙酸溶液,在37°C培养箱中作用30min以溶解结晶紫 ,所测的OD值是吸取哪一步分测得的OD值呢?需要将加入的33%冰乙酸溶液倒掉吗?

    • avatar 细菌之家

      @牛牛小宇 1、培养液要根据细菌来确定。2、33%冰乙酸能够将染色生物膜的结晶紫溶解。3、加入33%冰乙酸后,结晶紫溶解在冰乙酸中,然后将加入冰乙酸溶解后的96孔板直接放入酶标仪中测量,测冰乙酸溶液的OD值,不能将冰乙酸溶液倒掉。

  2. avatar 牛牛小宇

    你好!还想咨询您问题哦。(3) 每孔加入100μl甲醇固定15min,自然风干;这一步的自然风干需要多长时间呢,为什么我等了好久都不干,可不可以让甲醇固定15分钟后把甲醇吸出来吗?谢谢咯

    • avatar 细菌之家

      @牛牛小宇 你好!这一步是我们的疏忽。甲醇固定15min后,确实应该吸出甲醇,然后自然风干。
      我们已对相应的实验方法进行了修改,谢谢你的提问。

  3. avatar 牛牛牛小宇

    你好,还有一个步骤不是很懂 (2)将培养液吸出,每孔加入200μl无菌PBS缓冲液清洗板孔3次;我们做了3个对照孔,那对照孔还需要PBS清洗三次吗?

  4. avatar 牛牛牛小宇

    你好!谢谢您的回答,对我很有帮助。还有一个问题,对照孔是否也用PBS清洗,加入甲醇固定,加入结晶紫等等实验步骤,我不知道这是否是我实验误差的主要原因之一,期待您的答复,因为明天我想做一次重复,和您探讨!谢谢咯!

    • avatar 细菌之家

      @牛牛牛小宇 对照孔也需要用PBS清洗,加入甲醇固定,加入结晶紫等等实验步骤。

  5. avatar 匿名

    OD值有没有范围,药物母液浓度有没有范围,一般为什么?求解答

    • avatar snow

      @匿名 OD值是用酶标仪检测。酶标仪也是紫外光谱,紫外的有效测定范围通常是0.1-1.0,超出此范围后虽然也可以检测,但是不是呈线性关系,因此可能会不准确。
      “药物母液浓度”不知道指的是什么?

  6. avatar 匿名

    请问结晶紫的配置是草酸铵结晶紫吗,是和格兰仕染色一样的配方吗

  7. avatar 匿名

    抑菌率有没有大于100%的?为什么我算出来浓度大的有大于100%的,

  8. avatar 匿名

    抑菌率有没有大于100%的?为什么我算出来浓度大的有大于100%的,这是为什么。洗脱后如何计算它对生物膜的影响?求解答。

    • avatar 细菌之家

      @匿名 不太明白你说的抑菌率指的是什么,是怎么计算出来的?

      • avatar 匿名

        @细菌之家 抑菌率是溶剂OD-样品OD的差值比上溶剂OD×100%算出来的。

        • avatar 细菌之家

          @匿名 不应该用溶剂的OD值,应该用阴性对照的OD值来计算才对。

          • avatar 匿名

            @细菌之家 这里的阴性对照指的是什么可否具体,BHI和溶剂?我药液是有颜色的

          • avatar 细菌之家

            @匿名 实验步骤(10)以未接种菌的培养液作为阴性对照。
            意思是阴性对照孔除了不接种细菌外,其它操作都应与实验孔完全相同。
            如果使用的药液本身有颜色,这种情况真不知道怎么处理,不过我想也应该如上设置阴性对照。

  9. avatar 匿名

    请问清洗的时候需要震荡吗,如若震荡会破坏生物被膜吗?染色后流水冲洗不会冲洗掉染色的被膜吗?

    • avatar 匿名

      @匿名 清洗的时候应该轻微振荡。生物被膜的结合比较紧密,轻微流水冲洗不会冲掉的。

  10. avatar 匿名

    如何判断药是否有抑菌作用,抑菌率90%算不算是有作用,抑菌效果算不算好

    • avatar 细菌之家

      @匿名 判断一种药的抑菌作用好不好,不仅与抑菌率有关系,还与药物的浓度有关。
      如果在低浓度下就表现出很高的抑菌率,说明抑菌作用好。如果只是在高浓度下才表现出抑菌效果,说明抑菌作用不太好。

  11. avatar round tea

    我的实验把内容物倒掉以后,透光看到96孔板底部有细小的颗粒,想问一下那是不是形成的箘膜?

  12. avatar 匿名

    PBS缓冲液怎么配置

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来自外部的引用: 2

  • 细菌生物膜(菌膜)的培养与观察检测方法
  • 细菌生物膜(菌膜)体外培养方法及检测评估方法 | 细菌学专业网

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