保护性碱基与PCR扩增片段末端限制性酶切位点的切断情况

摘 要:

大多数限制酶对裸露的酶切位点不能有效切断,尤其当酶切位点位于片段末端时,通常酶切效率都很低,甚至不能切断。因此设计引物时需要在酶切位点两端加入1-3个保护性碱基。研究表明,基本上所有限制酶,在酶切位点旁加上3个以上的保护碱基后,都可以有效切断。

关键词:

在进行PCR克隆时,通常是先将PCR产物克隆到T载体,然后再用限制性内切酶酶切得到目的片段后,再亚克隆到目的载体中。事实上,也可以直接将扩增到的PCR产物经酶切后,与同样酶切处理后的目的载体进行连接,而不必经过克隆到T载体的中间步骤。

但实验证明,大多数限制酶对裸露的酶切位点不能有效切断。尤其当酶切位点位于片段末端时,通常的限制性内切酶的酶切效率都很低,有的酶甚至不能切断。因此,为了将PCR产物直接克隆到目的载体,就需要在设计引物时在酶切位点两端加入1-3个碱基的保护性碱基,才能使所设计的限制酶对其识别位点进行有效切断(参考文献:Zimmermann K, Schögl D, Mannhalter JW. Digestion of terminal restriction endonuclease recognition sites on PCR products. Biotechniques, 1998,24(4):582-584. )。

有人对十余种常用的限制性内切酶进行了实验,分别比较了各种限制酶在其酶切位点末端分别加1、2、3个保护碱基和不加保护性碱基的切断情况。表中的:(-) 为不能切断;(±) 为部分切断;(+) 为能完全切断。

image001

结果显示,基本上所有限制酶,在其酶切位点旁边加上3个以上的保护碱基后,都可以对其酶切位点进行有效切断。因此在进行PCR产物克隆实验时,在设计引物的时候通常要在末端再添加3个碱基,即保护性碱基。当然,如果实验设计先将PCR产物克隆到T载体,再亚克隆到目的载体,那么添不添加保护性碱基都可以。

    A+

除注明外,本站内容由 细菌之家 原创或整理,转载请注明出处及链接。

本文永久链接: http://www.bacteria.cn/html/2014/92.html

  • 请您留言:专业水平所限,谬误之处在所难免。如您发现不正之处,请在下面留言,谢谢!

发表评论

:?: :razz: :sad: :evil: :!: :smile: :oops: :grin: :eek: :shock: :???: :cool: :lol: :mad: :twisted: :roll: :wink: :idea: :arrow: :neutral: :cry: :mrgreen:

图片 表情