重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification)——可替代PCR的新型核酸检测技术

摘 要:

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)技术主要依赖重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶进行常温下的核酸扩增,是一种可以替代传统PCR的新型核酸检测技术。利用该技术能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低,特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

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重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)技术是由英国公司TwistDx Inc开发的一种可以替代传统PCR的新型核酸检测技术。利用该技术,能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低,特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

一、RPA技术的特点

1、RPA反应在常温下即可进行

常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤,而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的最适温度在37°C - 42°C之间,无需变性,在常温下即可反应。这无疑能大大加快PCR的速度。此外,由于不需要温控设备,RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

2、RPA检测的灵敏度很高

RPA能够将痕量的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平,从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA用不着复杂的样品处理,适用于无法提取核酸的现场实地检测。

3、既可用于DNA,也可用于RNA的扩增

RPA既可以扩增DNA,也可以扩增RNA,还省去了额外的cDNA合成步骤。不仅可以对扩增产物进行终点检测,还可以对扩增过程进行实时监控,甚至可以通过试纸条(侧流层析试纸条LFD)读取结果。

4、需要特殊的引物设计

RPA分析的关键在于扩增引物或探针的设计。PCR引物多半是不适用于该技术,因为RPA引物比一般PCR引物长,通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率,影响扩增速度和检测灵敏度。

在设计RPA引物时,变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟,需要多次摸索条件进行优化。目前虽然还没有设计软件可以使用,不过TwistDx Inc公司在自己的网站上提供了相应的筛选指南。

5、扩增长度在500bp以内

目前,TwistAmp试剂盒的扩增子长度在500bp以内。不过,经过特别优化的RPA扩增,也可以生成更长的扩增产物,或者减慢扩增速度(便于定量),甚至在更低的温度下进行反应。

6、可以进行多重扩增

RPA扩增技术还可以很简单的实现多重化。只需要在反应体系中增加引物或探针就可以一次性检测多个扩增产物。

7、不适合用于E. coli标准实验室菌株的扩增

受目前的生产方法所限,RPA反应不适合用于E. coli标准实验室菌株的扩增。

二、RPA技术的基本原理

RPA技术主要依赖于三种酶:能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶(Recombinase)、单链结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶(Polynerase)。这三种酶的混合物在常温下也有活性,最佳反应温度在37°C左右。

重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就会发生链交换反应形成并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合,防止进一步替换。在这个体系中,由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快,一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

 重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification)——可替代PCR的新型核酸检测技术

三、TwistDx Inc公司的RPA检测试剂盒

详见TwistDx Inc公司官网: http://www.twistdx.co.uk

RPA扩增基础体系(TwistAmp Basic)含有DNA扩增所需的所有试剂,实验者只需准备引物和模板。扩增结果可以通过凝胶电泳进行终点检测,产物纯化后可用于下游研究。

在基础体系中添入不同的酶和探针,就可以实现多样化的RPA应用。举例来说,在基础体系里添加逆转录酶(TwistAmp Basic RT),可以对RNA模板进行一步法扩增。

将RPA基础体系、专利的exo探针技术和核酸外切酶III结合起来(TwistAmp exo),能实现数据的实时读取,就像荧光定量PCR一样。不过反应终点的扩增子总量有所减少,适合获得强荧光信号进行动力学分析,不适合终点检测(比如跑胶)。在TwistAmp exo的基础上加入逆转录酶(TwistAmp exo RT),就可以一步实现RNA模板的实时扩增。

RPA基础体系、fpg探针技术和核酶fpg相结合,形成了一个实时报告体系(TwistAmp fpg)。这个体系的荧光累积比较慢,但终点的扩增子产量不会减少,因此也能支持终点分析。

RPA基础体系与核酶nfo的结合(TwistAmp nfo),能支持“三明治法”的终点检测,比如测流层析试纸条LFD。

需要注意的是,目前的TwistAmp扩增试剂盒都没提供RNase抑制剂。

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